一株金鯧魚源屎腸球菌的分離鑒定

宋華文 王金才 趙麗梅

摘要：為分離出可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用的乳酸菌，本實驗采集恒興集團(tuán)徐聞養(yǎng)殖基地3個月大的金鯧魚12條，將其腸道及其糞便分離、搗碎，利用MRS瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)初篩目標(biāo)分離菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特性，再通過生理生化鑒定法和16srDNA基因系列分析，最終確定一株分離菌株為屎腸球菌，為后續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖上的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：金鯧魚;屎場球菌;生化鑒定;16srDNA

中圖分類號：S94? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-3188（2021）02-012-03

益生菌是一類能定殖于宿主腸道內(nèi)、能產(chǎn)生健康功效，改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱[1]。乳酸菌因其無毒、無抗藥性、無殘留及無副作用等特點，是目前在動物飼料中運用最廣的一類益生菌。屎腸球菌是動物腸道中的一種常見菌，它是一種兼性厭氧的乳酸菌[2]。黏附力的強(qiáng)弱是篩選乳酸桿菌成為益生菌株的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。屎腸球菌為腸道共生菌，具有多種優(yōu)良生物學(xué)特性。屎腸球菌的黏附能力僅次于干酪乳桿菌，可在腸道中粘附生長，形成優(yōu)勢菌群。由于其生長速度快，具較好粘附力，產(chǎn)生乳酸以及一些抗菌物質(zhì)，在許多動物新出生 2～3 d 內(nèi)即可占有優(yōu)勢地位，從而增加有益菌數(shù)量，抑制有害菌，促進(jìn)腸道健康，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[3]。金鯧魚是一種重要的海洋生物資源，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，是魚片及魚糜制品深加工的優(yōu)質(zhì)原料。隨著我國人民生活水平的提高，以金鯧魚為代表的海洋養(yǎng)殖魚類深受青睞[4]。

本研究對健康金鯧魚的屎腸球菌進(jìn)行分離培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定，旨在為其在飼料添加劑和水質(zhì)改良劑的研發(fā)及應(yīng)用打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗動物

2017年4月，湛江市徐聞縣恒興集團(tuán)湛江南部海岸漁業(yè)有限公司養(yǎng)殖基地采集金鯧魚12條。

1.1.2? 主要試劑和儀器

MRS培養(yǎng)基和MRS肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，血瓊脂平板購自青島海博生物技術(shù)有限公司，革蘭氏染色液試劑盒購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，鏈球菌鑒定系統(tǒng) MID Strep MID-62廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。電子天平購自廈門佰倫斯電子科技有限公司，LDZX型-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠，生化培養(yǎng)箱購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，生物顯微鏡購自尼康儀器（上海）有限公司，單人單面水平凈化工作臺購自蘇州博萊爾凈華設(shè)備有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 分離純化

取采集的金鯧魚解剖，將腸道分離出來，用無菌剪刀剪成小段，于無菌環(huán)境下的研缽中研磨碎，用無菌生理鹽水連續(xù)稀釋至10-2，分別選擇稀釋度原液、10-1、10-2、10-3四個稀釋度的懸液100 uL，混合培養(yǎng)于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)24～48 h后，觀察結(jié)果。取單個菌落反復(fù)劃線分離至得到純化菌株，進(jìn)行血瓊脂平板培養(yǎng)，觀察細(xì)菌形態(tài);取純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡觀察染色特性。

1.2.2? 菌株培養(yǎng)液

將初步鑒定為腸球菌的菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37℃120 r/min培養(yǎng)24 h，以便下一步生理生化試驗與基因鑒定。

1.2.3? 生理生化試驗

取純化的菌株培養(yǎng)液接種于鏈球菌鑒定系統(tǒng) MID Strep MID-62，37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，記錄生化反應(yīng)結(jié)果。

1.2.4? 16srDNA基因系列分析

將獲得菌株培養(yǎng)液送往廣東省微生物分析檢測中心測16S rRNA 基因序列，將所得到的16srDNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast相似性搜索，獲取與分離菌株16S rDNA基因序列最為相近的序列。采用MEGA7.0軟件進(jìn)行多重序列同源性比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3? 結(jié)果

1.3.1? 血瓊脂平板培養(yǎng)

在血平板上37℃ 培養(yǎng)48 h，菌落表面光滑，不透明，乳白色，圓形隆起，邊緣整齊。

1.3.2? 革蘭氏染色

革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體球形或卵圓形，無鞭毛，無芽孢，單個或成雙排列，也有一部分短鏈狀排列，藍(lán)紫色，屬于革蘭氏陽性菌。

1.3.3? 生理生化特性

生理生化試驗表明，該菌兼性厭氧，在10℃～45℃條件下能生長，在6.5%氯化鈉中和40%膽汁中生長，接觸酶與氧化酶陰性，精氨酸雙水解酶陽性，可發(fā)酵乳糖、甘露醇、甘油，水解馬尿酸陽性，結(jié)果符合腸球菌生化標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合菌株形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果，可初步鑒定該分離菌株為腸球菌。

1.3.4? 16srDNA基因系列分析

該分離菌株HX01的16S rDNA測序序列在GeneBank經(jīng)Blast后顯示，與GeneBank中屎腸球菌和乳酸腸球菌的序列同源性均在99.09%與99.16%。選取GeneBank中相似度達(dá)99.0%以上的屎腸球菌和乳酸腸球菌的部分序列共5個16S rDNA序列經(jīng)過多重序列比對，使用MEGA7.0軟件按 Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，分離菌株HX01與屎腸球菌和乳酸腸球菌的同源性均達(dá)100%。結(jié)合菌株形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果及生理生化特征，可鑒定該菌株為屎腸球菌。

3? 討論

根據(jù)該分離菌株的菌落特征，革蘭氏染色后鏡檢的形態(tài)特征及生理生化特性，可初步鑒定為腸球菌。通過該菌株的16S rDNA基因序列分析的結(jié)果，鑒定該分離菌株為屎腸球菌。屎腸球菌為我國農(nóng)業(yè)部2013年公布的可作為飼料添加劑的微生物菌種，在畜禽上已經(jīng)得到了廣泛的研究與應(yīng)用。在水產(chǎn)動物上，有研究顯示，飼料中添加屎腸球菌能夠降低水產(chǎn)動物腸道中有害菌如腸道中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弧菌、嗜水氣單胞菌等的數(shù)量，提高水產(chǎn)動物的生長速率[5-7]。本研究從金鯧魚腸道中分離出屎腸球菌，說明屎腸球菌能夠在金鯧魚腸道中生長，可能對維持水產(chǎn)動物腸道微生態(tài)平衡起著重要作用。本實驗室將對該菌株進(jìn)行后續(xù)研究，即該菌株是否在水產(chǎn)動物消化道內(nèi)是否能夠發(fā)揮益生作用，如影響動物的營養(yǎng)特性，產(chǎn)生干擾素，產(chǎn)生非特異性免疫調(diào)節(jié)因子等;是否能夠調(diào)節(jié)水質(zhì)，如降低氨氮、亞硝酸鹽，抑制弧菌等致病菌等。

參考文獻(xiàn)

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