高分辨熔解曲線技術(shù)結(jié)合熒光實時PCR法同時檢測雞肉中4種食源性致病菌

張靜，周倩，唐夢君，張小燕，唐修君，陸俊賢，高玉時，顧榮

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇揚州 225125）

食品安全是關(guān)系到民生的重大事件，目前由于食源性致病菌引起的疾病在世界各國都引起重視，特別是微生物食物中毒事件[1]。國內(nèi)目前在禽肉食品中常見的食源性致病菌主要有沙門氏菌[2,3]、單增李斯特菌[4-6]、金黃色葡萄球菌[5,7]和空腸彎曲菌[8,9]。由于禽肉產(chǎn)品中的高攜帶率和污染狀況，建立能同時檢測上述4種菌快速檢測與鑒定方法是及時有效地控制和預(yù)防致病菌傳播的前提。

目前食源性致病菌的檢測方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法與生理生化檢驗，以及包括酶聯(lián)免疫法、分子生物學方法等快速檢測技術(shù)。傳統(tǒng)的檢測方法無法對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進行檢測，且耗時費力，獲得結(jié)果通常需要幾天的時間，不能實現(xiàn)有效的監(jiān)測和預(yù)防作用。且單獨檢測一種致病菌已無法滿足現(xiàn)今社會對致病菌檢測高效率的要求。多重PCR是在同一反應(yīng)管中同時完成多種致病菌的高效PCR擴增，從而實現(xiàn)多種致病菌DNA的同步快速檢測的技術(shù)。由于多重PCR可降低致病菌檢測過程中樣本、物資、試劑、工作量等占用的時間和空間，多重PCR技術(shù)在降低檢測成本方面顯得非常經(jīng)濟[10]。高分辨熔解曲線分析技術(shù)（High Resolution Melting，HRM）是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同熔解曲線的基因分析技術(shù)，通過與實時熒光PCR相結(jié)合，可以實時監(jiān)測溫度上升時雙鏈DNA的解鏈過程。且該技術(shù)達到了真正的閉管操作，避免傳統(tǒng)熒光操作和凝膠分離步驟，降低交叉污染的可能性及整體分析時間[11]。HRM技術(shù)以其高特異性、高通量、高靈敏度、低成本、快速等優(yōu)勢，在臨床診斷及基因分析上得到迅速發(fā)展，已成為生命科學研究中的熱點技術(shù)[12-20]，利用HRM技術(shù)能針對每一種細菌的固定DNA序列產(chǎn)生精確的Tm值，可將HRM分析技術(shù)應(yīng)用于多種致病菌的檢測中。因此，本文利用fimY、hly、nuc和orfC為靶基因，建立多重HRM-real time PCR檢測體系，采用高分辨熔解曲線分析技術(shù)同時檢測4種禽肉中常見的食源性致病菌（沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌），并進行了評價和初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與樣本

本實驗選取S. EntericaCMCC50041，L.monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. jejuniATCC33560這四株菌株作為目標試驗菌株（本實驗室自有或購買）。10份不含上述四種菌的空白雞肉樣本已經(jīng)過檢驗。

1.1.2 主要試劑

MeltDoctor TM HRM Master mix，美國Thermo公司；細菌DNA提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；CCDA培養(yǎng)基和MH培養(yǎng)基，英國OXOID公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和脫纖維綿羊血，青島海博生物技術(shù)有限公司；DEPC水，混合氣（5%O2、10% CO2和85% N2），南京特種氣體廠有限公司。

1.1.3 主要儀器

生物安全柜（A2），日本ESCO公司；生化培養(yǎng)箱（HPS-150），太倉市華美生化儀器廠；高壓滅菌鍋（SANYO MLS-3750），日本；三用恒溫水槽（XMTD-204），金壇市文化儀器有限公司；離心機（XT15R），日本HITACHI；超純水分離系統(tǒng)（Mliili-Q Advantage A10），美國Millipore公司；超低溫冰箱（DW-86L828），海爾；低溫冰柜（BC/BD-318HD），海爾、電子天平（XS105），瑞士METTLER TOLEDO公司；TM-EXB5002S，南京湯姆斯衡器有限公司；移液槍，德國Eppendorf公司；恒溫磁力攪拌器（HJ-3），江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；渦旋混勻器（VTX-3000L），比利時LMS公司；QuantStudio? 6 Flex全功能定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

廣泛查閱資料，搜索目標菌株內(nèi)保守、其他菌株間特異的基因片段，分別選取高度保守區(qū)域fimY、hly、nuc和orfC作為沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌的PCR擴增靶基因。在GeneBank上查詢并下載所有靶基因序列，采用DNAStar軟件中的seqman進行同源性分析，用生物軟件Primer Express V2.0對上述保守片段設(shè)計引物。所有引物對的可行性經(jīng)由NCBI上進行BLAST比對，驗證引物的保守性。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 用于多重HRM-real time PCR的引物Table 1 The primers of multiplex HRM-real time PCR

1.2.2 細菌的培養(yǎng)

取保藏于-80 ℃的甘油保藏菌種，腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌用接種環(huán)蘸取少許菌液劃線接種至營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，復(fù)活菌種后接種環(huán)蘸取少許菌液混入LB營養(yǎng)肉湯中，37℃ 160 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)16 h；空腸彎曲菌用接種環(huán)蘸取少許菌液接種于CCDA平板微需氧條件下42 ℃培養(yǎng)36 h后富集培養(yǎng)于MH血平板。富集培養(yǎng)后的細菌置于4 ℃冰箱冷藏備用。

多重HRM-real time PCR法對食品樣本檢測后的增菌步驟用SSL復(fù)合增菌培養(yǎng)基進行增菌。

1.2.3 DNA模板的提取

腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌采用液體LB培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，然后分別取1.5 mL菌液依照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，空腸彎曲菌將MH血平板純化培養(yǎng)的細菌用無菌棉簽刮下洗入PBS緩沖溶液，離心后去除上層液體。單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌按革蘭氏陽性菌提取，沙門氏菌和空腸彎曲桿菌按革蘭氏陰性菌提取，所提取的DNA模板作為反應(yīng)體系于-20 ℃貯存。

1.2.4 單重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)MeltDoctorTMHRM Master mix，每20 μL的PCR反應(yīng)體系包含10.0 μL MeltDoctor TM HRM Master mix，1.2 μL上游引物（5 μmol/L），1.2 μL下游引物（5 μmol/L），1.0 μL Template（反應(yīng)組以基因組DNA為模板，對照組的模板為無菌去離子水），其余以無菌去離子水補齊。

單重HRM-real time PCR反應(yīng)程序均為：95 ℃預(yù)變性1 min；以95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min擴增40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析，熔解程序為：95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，0.025 ℃/s的速率升至95 ℃維持15 s，60 ℃ 15 s。程序設(shè)置：instrument type：QuantStudioTM6 Flex System；block：Fast 96-Well (0.1 mL)；experiment type: High Resolution Melt；reagents：MeltDoctorTMHRM Ragents；properties:Standard。

1.2.5 多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的建立

在單重HRM-real time PCR反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上，在同一反應(yīng)管中，加入3對相應(yīng)的目標菌的特異性引物對各0.1 μL，其他成分和PCR反應(yīng)程序與單重HRM-real time PCR反應(yīng)一致，如1.2.4所示。

1.2.6 多重HRM-real time PCR反應(yīng)特異性

在多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上，以目標菌和非目標菌株的基因組DNA為模板進行多重HRM-real time PCR反應(yīng)，檢驗所建立體系的特異性。選取大腸桿菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、結(jié)腸彎曲桿菌為非目標菌株，以腸炎沙門氏菌、空腸彎曲菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌標準菌株為陽性對照，去離子水為陰性對照，進行特異性檢驗。

1.2.7 多重HRM-real time PCR反應(yīng)靈敏度

選取S. EntericaCMCC50041、L. monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. jejuniATCC33560四種菌株作為HRM-real time PCR反應(yīng)體系敏感性試驗的模板DNA來源。將四種菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。使用國標法測定菌液濃度，取菌液濃度為108拷貝數(shù)/mL的菌液，用生理鹽水按十倍梯度遞增稀釋，制備濃度分別為108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL 8個濃度梯度的菌懸液。每個稀釋度分別取1.5 mL依照DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.2.7.1 多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系檢測單一致病菌菌液的靈敏度

分別將四種目標檢測菌108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL濃度菌液的基因組DNA作為檢測模板，進行多重HRM-real time PCR反應(yīng)，從而驗證該多重體系對單一目標菌的檢測靈敏度。每個濃度制備至少3個重復(fù)樣本，只有所有3個重復(fù)樣本都被檢測為陽性的時候該樣本才能被判定為陽性。

1.2.7.2 多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系檢測多種致病菌菌液的靈敏度

將108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL的四種目標菌菌懸液中同濃度的混合，進行細菌DNA的提取，制備腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌四聯(lián)DNA模板，進行多重HRM-real time PCR反應(yīng)。每個濃度制備至少3個重復(fù)樣本，只有所有3個重復(fù)樣本都被檢測為陽性的時候該樣本才能被判定為陽性。

1.2.8 多重HRM-real time PCR反應(yīng)重復(fù)性

對多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性考察包括試驗間穩(wěn)定性和試驗內(nèi)穩(wěn)定性。以敏感性試驗中的S. EntericaCMCC50041，L. monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. JejuniATCC33560基因組DNA為檢測樣本，選取108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL 6個10*濃度梯度，每個濃度一式三份。同一樣本在同一試驗中擴增3次，用以評估該體系的批內(nèi)重復(fù)性，同一樣本分開3次不同時間進行3次試驗，以評估該體系的批間重復(fù)性。收集并計算每個稀釋度下檢測得到目標擴增產(chǎn)物Tm值得平均值、標準差（SD）和變異系數(shù)（CV值=standard deviation）。

1.2.9 人工染菌樣本的應(yīng)用

分別取 37 ℃過夜培養(yǎng)的S. EntericaCMCC50041，L. monocytogenesATCC19115、S. aureusATCC12598和C. jejuniATCC33560菌懸液各1 mL，用生理鹽水按10-1~10-6梯度進行10倍稀釋，制備濃度梯度菌懸液。然后將每個濃度的四種菌懸液各1 mL，同時接種到25 g雞肉樣本中，設(shè)置5 CFU/25 g、10 CFU/25 g和20 CFU/25 g雞肉樣本三種接種濃度。接種后的樣本置于20 ℃存放1 h后，加入200 mL SSL，均質(zhì)10 s[21]。所有樣本經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)后，樣本1000 g離心5 min，并用濾袋（Tekmar，Cincinnati，ohio）過濾除去粗糙的食物殘渣后，用試劑盒提取菌體DNA，多重HRM-real time PCR體系進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重HRM-real time PCR反應(yīng)建立

單重PCR反應(yīng)分別擴增出了4種致病菌對應(yīng)的4條特異性高分辨率熔解曲線和熔點峰，具有典型的擴增曲線，CT值在16.2~19.0之間，RSD值在0.28%~0.94%之間。如圖1所示，所對應(yīng)的沙門氏菌fimY基因的實際Tm值為82.2±0.019 ℃，單增李斯特菌hly基因的實際Tm值為78.2±0.022 ℃，金黃色葡萄球菌nuc基因的實際Tm值75.5±0.036 ℃，空腸彎曲菌orfC基因的實際Tm值為73.5±0.052 ℃。四種食源性致病菌Tm值之間均相互錯開，為多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系的建立奠定基礎(chǔ)。與Hoseinpour[22]等建立的檢測空腸彎曲桿菌的的Tm值為76.72±0.164 ℃相比，誤差更小。

圖1 四種菌單重HRM-real time PCR熔解曲線圖Fig.1 Four melt curve of HRM-real time PCR

2.2 多重HRM-real time PCR反應(yīng)建立

通過單重HRM-real time PCR反應(yīng)可知，4種目標致病菌在退火溫度為60 ℃和熔解速率0.025 ℃/s時均能夠獲得良好的擴增結(jié)果，故選60 ℃和熔解速率0.025 ℃/s作為多重反應(yīng)程序的退火溫度和熔解速率。但若直接將單重體系中的模板及引物對簡單的混合進行多重HRM-real time PCR反應(yīng)，則擴增效果不是很理想，熔解曲線峰不明顯，因此需要對多重反應(yīng)體系組分進行分組實驗并初步優(yōu)化。經(jīng)對不同模板濃度（1.0×108拷貝數(shù)/mL、1.0×109拷貝數(shù)/mL）和引物濃度（10 μmol/L、5 μmol/L）的選擇，按照低濃度優(yōu)先原則，建立了可擴增出4個不同Tm值高分辨熔解曲線峰的多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系，熔解曲線如圖2所示。

圖2 多重HRM-real time PCR熔解曲線圖Fig.2 Melt curve of multiplex HRM-real time PCR

2.3 多重HRM-real time PCR反應(yīng)特異性

多重PCR反應(yīng)體系特異性檢驗結(jié)果表明，所有目標菌均出現(xiàn)陽性擴增，而其他非目標菌株，均未出現(xiàn)擴增。表明多重PCR反應(yīng)體系具有良好的特異性。

2.4 多重HRM-real time PCR反應(yīng)靈敏度

多重HRM-real time PCR反應(yīng)靈敏度結(jié)果見表2。表2表明，隨著稀釋梯度的不斷增加，即菌濃度的不斷減少，其對應(yīng)Ct值增大，各食源性致病菌Tm值保持穩(wěn)定，直至稀釋至102拷貝數(shù)/mL時達到檢出限，其平均Ct值為16.2~30.8之間，標準差在0.05~0.58之間。結(jié)合平板計數(shù)結(jié)果顯示，沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌的檢測靈敏度分別為102拷貝數(shù)/mL，結(jié)果表明上述多重HRM-real time PCR體系對上述4種單一食源性致病菌的檢測均具有良好的靈敏度。

表2 多重HRM-real time PCR反應(yīng)檢測單一致病菌的靈敏度Table 2 Sensitivity of multiplex HRM-real time PCR in simple bacterium

表3 是反應(yīng)體系同時檢測四種食源性致病菌結(jié)果，隨著稀釋梯度的不斷增加，即菌濃度的不斷減少，其Ct值對應(yīng)增大，4種食源性致病菌Tm值保持穩(wěn)定且都能檢出，直至稀釋至102拷貝數(shù)/mL時達到檢出限，其平均Ct值為14.4~30.3之間，標準差為0.17~0.96之間。對比兩個結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Ct值無顯著差異，表明多種菌混合并不會降低HRM-realtime PCR反應(yīng)的靈敏度，反應(yīng)體系穩(wěn)定性良好。對比類似體系，該多重檢測體系達到的靈敏度高于Forghani[23]等運用該方法所建立的檢測蠟樣芽孢桿菌、李斯特菌（3.7×103CFU/mL），周千渝[24]等利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速檢測并鑒定從鮮食蔬菜中分離到的5種食源性致病菌（106~109CFU/mL），楊夢婕[25]等利用GeXP多重聚合酶鏈式反應(yīng)法檢測沙門菌、大腸埃希菌0157:H7、單核細胞增生李斯特菌、志賀菌和副溶血性弧菌（103CFU/mL）和楊國興[26]等利用多重PCR快速檢測肉制品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌（103CFU/mL）；與鞠鶴鵬[27]等利用結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴增和微流控芯片技術(shù)檢測沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌三種食源性致病菌靈敏度接近（100 CFU/mL）。

表3 多重HRM-real time PCR反應(yīng)檢測多種致病菌的靈敏度Table 3 Sensitivity of multiplex HRM-real time PCR in four bacterium

2.5 多重HRM-real time PCR反應(yīng)重復(fù)性

多重HRM-real time PCR反應(yīng)重復(fù)性結(jié)果見表4。108拷貝數(shù)/mL~103拷貝數(shù)/mL 6個稀釋濃度的Tm值表明，多重HRM-real time PCR反應(yīng)體系具有高度的重復(fù)性。Tm值的試驗內(nèi)CV值為：沙門氏菌0.03%~0.12%，單增李斯特菌0.03%~0.12%，金黃色葡萄球菌0.06%~0.32%，空腸彎曲菌0.03%~0.21%；試驗間CV值為：沙門氏菌0.55%~1.12%，單增李斯特菌0.53%~2.12%，金黃色葡萄球菌0.45%~2.02%，空腸彎曲菌0.66%~2.01%。組內(nèi)和組間Tm值的CV值均較低，提示該體系具有較高的重復(fù)性。

表4 多重HRM-real time PCR體系的重復(fù)性Table 4 Reproducibility of multiplex HRM-real time PCR

2.6 人工染菌樣本的檢測

陽性對照中沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌Tm值分別為82.20 ℃、78.24℃、75.45 ℃和73.45 ℃。實驗表明，在Tm值上，5 CFU/25 g、10 CFU/25 g和20 CFU/25 g三種感染濃度下，10份雞肉樣本中四種目標菌的目標擴增產(chǎn)物Tm值與直接從目標菌株菌液中提取出來的的Tm值對比，無顯著差異。在靈敏度上，感染樣本在進行37 ℃24 h的增菌后，對沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌，多重HRM-real time PCR法均能達到5 CFU/25 g的檢測限，結(jié)果見表5。在人工染菌樣品的檢出限高于Germini A[28]等利用多重PCR檢測全蛋中大鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157:H7的檢出限（10 CFU/25 g）。

表5 多重HRM-real time PCR體系對人工感染樣本敏感度Table 5 Tm value of artificaially-inoculated samples in multiplex HRM-real time PCR

3 結(jié)論

綜上所述，相較于胡雙芳[29]等所建立的食源性致病菌檢測方法，本研究所構(gòu)建的實時熒光定量PCR結(jié)合高分辨熔解曲線方法能在一個體系中同時檢測沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌，具有操作簡單、快速、特異性強等優(yōu)點，為食品中多種致病菌污染的快速檢測提供了新的手段，有望發(fā)展為快速同時檢測食品中多種致病菌污染的有效手段。