白皮杉醇對氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸抗氧化能力、黏膜形態(tài)和屏障功能的影響

賈沛璐，張 昊，陳亞楠，季書立，王 恬

(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095)

生物體在進行以氧氣為基礎(chǔ)的能量代謝過程中，涉及多種復雜的氧化還原反應(yīng)，故不可避免地產(chǎn)生多種活性氧(reactive oxygen species, ROS)。若ROS未被及時清除，會攻擊細胞脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，引發(fā)過氧化損傷并產(chǎn)生氧化應(yīng)激[1]。在正常動物體內(nèi)，ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，機體通過抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生能夠清除ROS的物質(zhì)和酶，以保證機體不受ROS的影響[2]。然而，當動物外界環(huán)境發(fā)生變化或者機體抗氧化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全的時候，機體不能夠及時有效清除ROS，導致過量ROS積聚，從而發(fā)生氧化應(yīng)激[3]?？漳c作為機體從外界環(huán)境吸收營養(yǎng)物質(zhì)、溝通內(nèi)外環(huán)境的器官，易受內(nèi)外環(huán)境的影響而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常、屏障功能損傷、消化吸收功能受損等現(xiàn)象[4]。因此，研究氧化應(yīng)激對腸道的影響變得尤為重要。敵草快(DQ)是一種常用的氧化應(yīng)激誘導劑，其能在動物體內(nèi)迅速產(chǎn)生大量ROS并引發(fā)氧化應(yīng)激[5-6]，而斷奶仔豬易發(fā)生斷奶應(yīng)激導致腸道損傷，進而加劇氧化應(yīng)激程度。白皮杉醇(PIC)作為一種植物源天然抗氧化劑，因其顯著的抗氧化生物活性而受到廣泛關(guān)注。研究表明，PIC能夠增強抗氧化酶活性，上調(diào)抗氧化基因的表達，從而緩解氧化應(yīng)激損傷[7-8]，Yang等[9]研究表明，PIC能降低由脂肪變性導致的氧化應(yīng)激Hep-G2細胞內(nèi)的ROS含量，Hao等[10]則發(fā)現(xiàn)，PIC通過促進Nrf2核移位增強人視網(wǎng)膜上皮色素細胞的抗氧化能力，而Zhu等[11]研究表明，PIC通過降低人角質(zhì)形成細胞的氧化應(yīng)激水平抑制了細胞的異常增殖。然而，目前關(guān)于PIC抗氧化活性的研究多集中于細胞水平，在動物機體水平的研究還鮮有報道。

本試驗使用DQ誘導斷奶仔豬發(fā)生氧化應(yīng)激，建立氧化應(yīng)激的腸道損傷模型，并通過灌喂PIC來探究其對斷奶仔豬空腸抗氧化酶活性、抗氧化相關(guān)基因表達以及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗選取體重相近的28日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬共54頭，其平均體重為(8.13±0.41) kg，隨機分為3個處理組(每組6個重復，每個重復3頭豬)：對照組(CON)灌喂0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液(Sigma-Aldrich, 美國)并在屠宰前24 h注射生理鹽水，敵草快組(DQ-CON)灌喂0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液并在屠宰前24 h注射DQ(10 mg·kg-1，Sigma-Aldrich, 美國)，敵草快+白皮杉醇組(DQ-PIC)灌喂含有PIC(80 mg·kg-1，杭州瑞樹生物科技有限公司，杭州)的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液并在屠宰前24 h注射DQ。本試驗中，10 mg·kg-1DQ的注射劑量參考Cao等[12]的方法。目前，尚無PIC在斷奶仔豬上的研究報道，故本試驗參考了PIC母體化合物——白藜蘆醇的應(yīng)用劑量，即80 mg·kg-1[13-15]。PIC是一種白藜蘆醇衍生物，與白藜蘆醇具有相似的化學結(jié)構(gòu)和生物活性，且同屬于植物源多酚活性物質(zhì)[16]。因此認為，白藜蘆醇在斷奶仔豬上的最適劑量對于PIC而言具有重要的參考價值。所有組別的仔豬均飼喂基礎(chǔ)日糧，自由采食，充足飲水?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧的組成和營養(yǎng)水平

(續(xù)表1)

1.2 樣本采集

在36日齡時，從每頭仔豬的前腔靜脈采集血液，并在4 ℃下以4 000 r·min-1離心10 min，收集血清。所有仔豬被電擊致暈，然后采用頸動脈放血的方法進行處死后迅速剖開腹腔，分離出腸道，并從空腸中段部分截取長度約為1 cm的腸段，然后用無菌生理鹽水沖洗，并立即放入4%多聚甲醛緩沖液中進行固定，以進行后續(xù)的形態(tài)分析?？v向切開相鄰的腸段后，小心地刮下空腸黏膜并裝入冷凍保存管，迅速放入-80 ℃的液氮中保存待進一步分析。

1.3 空腸的形態(tài)學分析

將空腸樣品在4%多聚甲醛中固定24 h后，使用梯度濃度乙醇對其進行脫水，然后包埋在石蠟中。用切片機將包埋有樣品的石蠟塊切成5 μm厚的切片，并在42 ℃下烘烤8 h，然后用蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)進行染色。最后使用倒置顯微鏡(日本Nikon公司，型號為ECLIPSE 80i)對經(jīng)過以上處理后的切片進行觀察和分析。使用Image-Pro Plus軟件(美國Media Cybernetics公司，版本為Windows 6.0)對切片的空腸絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)進行測量，每張切片隨機選取至少10個視野。

1.4 空腸抗氧化能力測定

將大約300 mg的空腸黏膜冷凍樣品與生理鹽水按照1∶4(質(zhì)量∶體積)的比例進行混合，然后使用高速勻漿機勻漿制成勻漿液。將勻漿液于4 ℃下4 000 r·min-1離心10 min后，提取上清液進行分析。上清液中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)的活性，以及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量的測定均使用相應(yīng)的商業(yè)試劑盒(南京建成生物科技研究所, 南京)按照對應(yīng)的說明書進行測定。

1.5 空腸mRNA的提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)

使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific， 美國)對空腸黏膜組織中的總mRNA進行提取，并對mRNA的濃度和純度進行檢測。使用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，大連)對總mRNA 進行反轉(zhuǎn)錄，然后使用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒(TaKaRa，大連)和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(Applied Biosystems，美國)進行體系為20 μL的qRT-PCR反應(yīng)：上、下游引物各0.4 μL、10 μL SYBR Premix Ex Taq、6.8 μL超純水、2 μL cDNA模板和0.4 μL ROX Reference Dye。反應(yīng)過程：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，40個循環(huán)；60 ℃ 30 s。以β-actin作為內(nèi)參基因，2-△△Ct法計算目標基因的相對表達豐度，試驗中使用的引物序列見表2。

表2 本試驗中使用的引物序列

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，并用“平均值±標準誤(SE)”來表示。使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并使用Tukey 法進行組間比較以檢驗組間差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PIC對氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)的影響

由表3可知，DQ-CON組仔豬的空腸VH和VH/CD均顯著低于CON組(P<0.05)。而DQ-PIC組仔豬空腸的VH/CD顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。各組之間的空腸CD均沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 PIC對氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸屏障和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

與CON組仔豬相比，DQ-CON組仔豬血漿DAO含量顯著升高(P<0.05)，且空腸OCLN表達量顯著下調(diào)(P<0.05)；而DQ-PIC組仔豬的血漿DAO含量則顯著低于DQ-CON組(P<0.05)，同時其空腸OCLN表達量顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。

2.2 PIC對氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸黏膜抗氧化能力的影響

由表4可知，DQ-CON組的T-SOD活性、GPx活性和CAT活性均顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組中的上述酶活性均顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。同樣地，DQ-CON組的T-AOC顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組的T-AOC則顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。DQ-CON組的MDA含量顯著高于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組顯著低于DQ-CON組(P<0.05)。

表4 PIC對氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸黏膜的抗氧化酶活性的影響

為了進一步探究PIC對氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸抗氧化能力在RNA水平上的影響，本研究測定了空腸抗氧化相關(guān)基因的相對表達豐度，結(jié)果見表5。DQ-PIC組NQO1基因的相對表達豐度顯著高于DQ-CON和CON組(P<0.05)，而DQ-CON組與CON組之間則沒有顯著差異(P>0.05)。DQ-CON組SOD1基因的相對表達豐度顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組則顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。DQ-CON組HO1基因的相對表達豐度顯著高于CON組(P<0.05)，而 DQ-PIC組顯著高于DQ-CON組(P<0.05)。DQ-CON組SOD2和GPx1基因的相對表達豐度顯著低于CON組(P<0.05)，而DQ-PIC組和DQ-CON組相比沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 PIC對氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸黏膜抗氧化相關(guān)基因相對豐度的影響

3 討 論

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的天然大分子化合物，因其豐富的來源和多樣化的生物活性，近年來逐漸成為研究熱點。PIC是一種具有良好抗氧化活性的天然植物多酚，存在于葡萄、甘蔗及大黃蘚等多種植物中。PIC分子結(jié)構(gòu)中的兩個酚羥基和一個碳碳雙鍵具有強還原性，可迅速清除細胞和組織中的ROS，降低氧化應(yīng)激的發(fā)生風險[17-18]。DQ是一種常見的接觸聯(lián)吡啶基除草劑[19]，能夠利用分子氧產(chǎn)生超氧陰離子自由基，并與其他ROS共同誘導細胞線粒體損傷[20-22]。受損的線粒體會釋放更多的ROS，繼而引起機體氧化應(yīng)激[23-25]。因此，DQ常用于建立嚙齒動物與仔豬等動物氧化應(yīng)激模型[26-28]。

在本試驗中，DQ的注射引起了DQ-CON組斷奶仔豬血清DAO含量顯著升高，并且該組的空腸黏膜形態(tài)也受到了破壞，表現(xiàn)為絨毛高度和VH/CD的顯著降低。小腸作為吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)是動物機體進行正常生長發(fā)育的基礎(chǔ)，而小腸絨毛高度，隱窩深度以及VH/CD則是衡量腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要指標[29]。小腸絨毛上皮細胞負責吸收消化道內(nèi)的氨基酸、無機鹽、葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)，且絨毛高度與吸收能力成正相關(guān)，而VH/CD則綜合反映了小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)。同時，注射DQ后，DQ-CON組仔豬空腸黏膜中MDA含量顯著升高，T-SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的活性均受到了抑制。宋小珍等[30]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬小腸上皮在氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生大量的ROS，進而破壞體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，導致抗氧化酶活的降低。王遠孝等[31]研究則表明，氧化應(yīng)激狀態(tài)下仔豬小腸黏膜MDA含量上升，T-AOC下降。以上研究結(jié)果與本試驗相似，而Maeda 等[32]研究也指出，腸道氧化應(yīng)激會導致小腸細胞通透性增加以及形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，這表示，DQ使斷奶仔豬空腸發(fā)生了氧化應(yīng)激，降低了空腸抗氧化能力，從而導致了空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，也表明了本試驗中斷奶仔豬氧化應(yīng)激模型的成功建立。

PIC在本試驗中顯示出了促進腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能修復作用。本試驗結(jié)果顯示，PIC使氧化應(yīng)激斷奶仔豬空腸絨毛高度增加且VH/CD增加，這反映PIC促進了腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的修復。屏障功能是小腸上皮細胞另一項重要功能，而緊密連接則是構(gòu)成上皮細胞屏障功能的最主要結(jié)構(gòu)，由OCLN等結(jié)構(gòu)蛋白組成[33]。OCLN蛋白與細胞間通透性和移動性有關(guān)，其缺失會導致腸上皮細胞通透性增加，進而導致腸道屏障功能受損[34]。在本試驗中，PIC促進了氧化應(yīng)激仔豬空腸黏膜中OCLN蛋白的mRNA表達量，提示其促進了腸道屏障功能的恢復。而PIC對于空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能的修復作用可能是通過緩解腸道氧化應(yīng)激來實現(xiàn)的。

PIC在本試驗中顯示出了緩解腸道氧化應(yīng)激損傷的作用。作為天然的抗氧化劑，PIC能夠有效地清除各種自由基。已有研究表明，PIC能高效地清除過氧化自由基[16,33]，而李曉霞等[35]則報道，PIC具有較強的清除羥自由基的生物活性，這可能與PIC分子結(jié)構(gòu)中的4個酚羥基有關(guān)。PIC也可以刺激動物機體抗氧化系統(tǒng)，提高抗氧化水平，從而降低氧化應(yīng)激損傷。本試驗結(jié)果顯示，PIC使斷奶仔豬空腸黏膜中T-SOD、GPx和CAT的酶活升高，并且上調(diào)了NQO1、SOD1和HO1的基因相對表達量，進而降低了MDA的含量，緩解了氧化應(yīng)激損傷。SOD是一類重要的解毒酶，包括SOD1和SOD2，它們存在于所有能夠進行氧化還原過程的生物中，以谷胱甘肽(GSH)作為反應(yīng)底物，與GPx和CAT一起清除機體產(chǎn)生的ROS[36-37]。MDA是自由基直接進攻生物膜脂質(zhì)部分而產(chǎn)生的一種脂質(zhì)過氧化物，也是反應(yīng)機體氧化應(yīng)激程度的一項重要指標[38]。Zhang等[39]發(fā)現(xiàn)，PIC能顯著降低老年大鼠海馬皮質(zhì)組織中的MDA含量，增加SOD和CAT的酶活。Lu等[8]的研究結(jié)果顯示，PIC能夠促進Nrf2的核移位，進而上調(diào)其下游HO1和NQO1抗氧化基因的表達，提高ARPE-19細胞的抗氧化能力。Jeong等[40]則發(fā)現(xiàn)，PIC發(fā)揮其抗氧化作用是通過促進HO1基因的表達來實現(xiàn)的，沉默HO1基因以后，PIC的抗氧化作用就消失了。以上研究結(jié)果均與本試驗結(jié)果相似，PIC提高了抗氧化酶活，上調(diào)了抗氧化相關(guān)基因的表達，從而降低了MDA含量，緩解了氧化應(yīng)激損傷。據(jù)此推測，PIC在生物體內(nèi)的抗氧化作用一方面通過直接清除自由基來完成，另一方面則是借助Nrf2/HO1抗氧化信號通路刺激細胞或生物體的抗氧化系統(tǒng)來完成，但其具體機制還有待進一步探究。

4 結(jié) 論

本研究中，腹腔注射10 mg·kg-1DQ成功引起了斷奶仔豬空腸氧化損傷，進而影響了空腸黏膜形態(tài)和屏障功能。而斷奶仔豬灌喂80 mg·kg-1PIC能夠有效緩解敵草快誘導的空腸氧化損傷，改善黏膜形態(tài)，促進屏障功能的恢復。