鴨坦布蘇病毒病的研究進(jìn)展

張帆帆，曾艷兵，方紹培，李海琴，康昭風(fēng)，譚美芳，譚 佳，楊 群，韋啟鵬

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200)

鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)是黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的一種新型黃病毒，可引起雛鴨腹瀉和神經(jīng)癥狀，蛋鴨卵巢出血壞死、產(chǎn)蛋量急劇下降，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡的急性高度接觸性傳染病[1-2]。2010年，鴨坦布蘇病毒病在我國福建、浙江、江蘇等地區(qū)的蛋種鴨中首次暴發(fā)，以種鴨和蛋鴨易感性最高。目前，該病的感染宿主已擴(kuò)大至肉鴨、番鴨、鵝、蛋雞、鴿子、麻雀等多種禽類，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展[3-10]。

自2014年后，我國陸續(xù)研制出了DTMUV弱毒疫苗、滅活疫苗等多種疫苗，商業(yè)化疫苗的廣泛使用讓我國鴨坦布蘇病毒病發(fā)病率急劇下降，僅呈現(xiàn)散發(fā)狀態(tài)[5, 11]。然而，參與病毒吸附、侵入和宿主特異性免疫反應(yīng)等重要過程的抗原蛋白(E蛋白)發(fā)生重要變異，進(jìn)而引發(fā)免疫失敗或疫苗保護(hù)率下降，致使DTMUV的防控難度增加[12]。此外，DTMUV還可在小鼠體內(nèi)復(fù)制，具有高度的神經(jīng)毒性和與年齡相關(guān)的神經(jīng)侵襲性，并且對(duì)人神經(jīng)和肝細(xì)胞系也高度敏感，具有潛在的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，因此，對(duì)DTMUV進(jìn)行深入研究具有重要意義[13-15]。本文結(jié)合DTMUV的分子生物學(xué)特征、流行現(xiàn)狀、天然抗病毒的分子機(jī)制以及疾病診斷的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為該病原的基礎(chǔ)研究和診斷防控提供參考。

1 DTMUV分子生物學(xué)特征

DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的成員，為有囊膜單股正鏈線性的RNA病毒，呈二十面體對(duì)稱，具有典型的黃病毒形態(tài)。病毒基因組全長(zhǎng)約11 kb，只包含一個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)編碼多聚蛋白前體，該蛋白前體可由病毒蛋白酶和宿主蛋白酶剪切成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(核衣殼蛋白C、前膜蛋白prM和囊膜蛋白E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，基因組結(jié)構(gòu)為5′-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-UTR-3′(圖1)[9]。黃病毒通常以帽子依賴的方式翻譯，而登革病毒、寨卡病毒、乙腦病毒、坦布蘇病毒可以通過不依賴帽子的方式在哺乳動(dòng)物、鳥類和蚊子細(xì)胞中翻譯。抑制非帽子依賴性翻譯的突變降低了DTMUV的增殖，延遲了受感染鴨胚的死亡，但不能阻止死亡[16]。因此，DTMUV的5′UTR和3′UTR使病毒能夠使用不依賴于帽子和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)的RNA基因組翻譯策略，這不僅可以逃避宿主翻譯中斷，還可用于生產(chǎn)黃病毒的減毒變異體作為潛在的候選疫苗。核衣殼蛋白C能與病毒基因組相互結(jié)合組裝成核衣殼，保護(hù)基因組免受RNA酶降解。prM是M蛋白的前體蛋白，成熟的M蛋白嵌合在病毒囊膜的脂質(zhì)雙分子層中，對(duì)維持E蛋白的空間構(gòu)象十分重要[9]。E蛋白是DTMUV最大的結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒吸附、侵入和宿主特異性免疫反應(yīng)等重要過程，與不同毒株間的毒力差異密切相關(guān)[17-18]。E蛋白經(jīng)過不同程度的空間折疊可以形成特殊的空間結(jié)構(gòu)，可以分為3個(gè)區(qū)域：中央結(jié)構(gòu)域、強(qiáng)親水結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域。中央結(jié)構(gòu)域在強(qiáng)親水結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域之間起到連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的橋梁作用；強(qiáng)親水結(jié)構(gòu)域主要參與E蛋白二聚體的形成過程；而C末端結(jié)構(gòu)域的主要作用是介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合從而促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞。同時(shí)，該蛋白有多個(gè)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體的病毒毒力決定簇，可以引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，廣泛應(yīng)用于疫苗研究中，是疫苗研制的潛力蛋白[19-21]。

圖1 鴨坦布蘇病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖

非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白緊鄰，主要在病毒入侵、復(fù)制和翻譯過程發(fā)揮重要作用，但許多功能及其作用機(jī)制依然未知。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1屬于高保守性的分泌型糖蛋白，依靠其可溶性補(bǔ)體結(jié)合活性誘導(dǎo)產(chǎn)生非中和性抗體，并且與病毒復(fù)制、抗病毒感染、免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)[22]。NS2A和NS2B均為疏水性蛋白，其可以相互作用構(gòu)成病毒的主要蛋白酶，對(duì)病毒多聚蛋白進(jìn)行剪切和加工[23]。NS3具有絲氨酸蛋白酶、核苷酸三磷酸酶和RNA解旋酶活性，可參與病毒RNA的復(fù)制，改變病毒與宿主的相互作用。研究顯示，NS3的HELICc結(jié)構(gòu)域與PRDX1結(jié)合，調(diào)節(jié)p38/絲裂原活化蛋白激酶通路，使病毒逃避宿主免疫反應(yīng)[24]。NS4A和NS4B在病毒復(fù)制和病毒-宿主相互作用中起多種作用，NS4A與NS3、NS4B與NS5形成的蛋白復(fù)合體，抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒反應(yīng)。NS5為黃病毒分子量最大、最保守的蛋白，含有甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性，可抑制干擾素和IL-8的表達(dá)。根據(jù)其保守性和在病毒復(fù)制過程中的重要功能，可用于開發(fā)診斷和治療方法[25-26]。

2 DTMUV的流行現(xiàn)狀

1955年，在馬來西亞的三帶喙庫蚊中首次分離出坦布蘇病毒原型毒株MM1775。2007年，在泰國觀察到一種與鴨嚴(yán)重神經(jīng)癥狀和產(chǎn)蛋損失有關(guān)的嚴(yán)重傳染病，病原為DTMUV[27-28]。2013—2014年，泰國多家農(nóng)場(chǎng)發(fā)生了DTMUV疫情，平均感染率為17.19%，死亡率為10%～30%[29]。1995年，我國河北地區(qū)發(fā)生鴨繁殖障礙和神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)的疫病，直至1997年才分離到DTMUV毒株。2010年以來，DTMUV以高感染率(高達(dá)90%)和較高死亡率(5%～30%)為特征，在我國各養(yǎng)鴨場(chǎng)大面積暴發(fā)[30-31]。該病首先發(fā)現(xiàn)于浙江，隨后蔓延至沿海13個(gè)省市的主要養(yǎng)鴨地區(qū)，以雛鴨生長(zhǎng)遲緩、厭食和死亡，蛋鴨產(chǎn)蛋下降、腹瀉且排綠色糞便為基本臨床特征，病程長(zhǎng)達(dá)數(shù)周，可繼發(fā)大腸桿菌感染，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的核心傳染病[32]。DTMUV對(duì)7周齡以下的雛鴨具有較強(qiáng)致病性，其中雛鴨感染日齡對(duì)疾病嚴(yán)重程度有很大影響[33]。DTMUV感染1～9日齡北京鴨后導(dǎo)致18%～100%的死亡率；而感染2～7周齡北京鴨，不同毒株所導(dǎo)致的嚴(yán)重程度不一，但無死亡發(fā)生。此外，研究發(fā)現(xiàn)，DK/TH/CU-1毒株感染4周齡鴨只，出現(xiàn)了22.86%的死亡率。蛋鴨感染后2 d出現(xiàn)厭食，3～4 d出現(xiàn)產(chǎn)蛋急劇下降，甚至絕產(chǎn)，并伴有綠色糞便，其中新開產(chǎn)鴨群表現(xiàn)最為嚴(yán)重。Yang等[34]通過建立雛鴨TMUV感染模型，證實(shí)TMUV進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存活和增殖引起腦炎，最終破壞血腦屏障。肉鵝感染TMUV的發(fā)病日齡在40～60日齡，表現(xiàn)為拉綠色稀便，翅和雙腳麻痹，死淘率約10%。然而在2019年3月，我國東北地區(qū)的金定鴨群出現(xiàn)以翻個(gè)、腳軟、排綠色稀糞為特征的DTMUV感染病例，無明顯的細(xì)菌感染，2～4周齡 鴨死亡率高達(dá)40%，5～6周齡鴨的死亡率高達(dá)25%，7～8周齡鴨的死亡率低于10%[4, 11, 35]。通過致病性試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，DTMUV H毒株(2.1亞群)比Y毒株(2.2亞群)對(duì)3周齡雛鴨的致病性更強(qiáng)[11]。最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TMUV病毒的E蛋白T367K突變?cè)诓《炯?xì)胞適應(yīng)和毒力衰減中起著主導(dǎo)作用，并且NS1在遺傳進(jìn)化上為病毒的高變區(qū)，其是否為影響病毒臨床癥狀的改變因素需要進(jìn)一步研究[4, 18, 24]。根據(jù)DTMUV ORF核苷酸的遺傳進(jìn)化關(guān)系可分為3個(gè)群，中國主要流行2.1亞群、2.2亞群和3亞群，泰國和馬來西亞等地區(qū)主要流行1亞群和2.1亞群[36]。通過地理系統(tǒng)分析表明，坦布蘇病毒可能是從馬來西亞、泰國等東南亞國家向中國華南地區(qū)擴(kuò)散，并進(jìn)一步向山東等北方地區(qū)擴(kuò)散。通過病毒監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在鴿子和野鴨等野生鳥類中檢測(cè)出TMUV，而東亞-澳大利亞飛行通道是世界上候鳥的主要飛行通道之一，該飛行通道經(jīng)過許多國家，包括馬來西亞、泰國和中國等。因此，TMUV的傳播可能通過該飛行通道的候鳥傳播，還需要對(duì)候鳥感染TMUV的流行病學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的研究來確定[37]。近幾年來，鴨坦布蘇病毒病在我國各地此起彼伏，時(shí)有發(fā)生，并且不斷有DTMUV感染種雞、蛋雞和鵝等禽類的報(bào)道。在自然條件下，DTMUV可通過庫蚊作為媒介傳播病毒，是該病表現(xiàn)出明顯季節(jié)性的重要原因[38]。但通過長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該病在一年四季均可發(fā)生，在秋冬季節(jié)依然出現(xiàn)流行，說明其還可通過其他的傳播途徑感染。鳥類尤其是家禽是DTMUV的儲(chǔ)存宿主，在傳播過程中可能起著非常重要的作用[39]。此外，糞口傳播、空氣傳播和垂直傳播也是該病的主要傳播方式[40-41]。

3 DTMUV與宿主天然免疫應(yīng)答

3.1 先天免疫應(yīng)答

宿主的天然免疫是抵御病原體入侵的第一道防線，在早期抵御病毒感染中發(fā)揮重要作用。模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRRs)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以識(shí)別病原體，激活特定的信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致先天免疫的建立和獲得性免疫的發(fā)展。在天然免疫的主要四大信號(hào)通路中，其模式識(shí)別受體(PRRs)主要包括Toll樣受體(TLRs)、RIG-I樣受體(RLRs)、NOD樣受體(NLRs)和DNA受體(AIM2、cGAS、DAI)等。不同的PRRs定位在細(xì)胞不同位置：TLRs主要鑲嵌在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)中；RLRs主要定位在細(xì)胞質(zhì)，它們特異性地識(shí)別相應(yīng)病原微生物PAMPs分子；DNA受體主要定位在細(xì)胞質(zhì)，識(shí)別胞質(zhì)中的dsDNA結(jié)構(gòu)，是一組I型跨膜蛋白，感知不同的入侵病原體在細(xì)胞膜外以及內(nèi)體和溶酶體內(nèi)的情況。在鴨中的TLRs包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7，可以感知細(xì)胞膜外的病原體及內(nèi)吞小體內(nèi)的病毒和微生物體基因組。DTMUV感染鴨胚成纖維細(xì)胞，TLR5和TLR3轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而TLR7的表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。激活的TLR3和TLR7募集接頭蛋白，分別誘導(dǎo)TRAF6和MyD88，TRAF6與RIP1、TAK1結(jié)合蛋白2、TAK1結(jié)合蛋白3、NEMO等形成的復(fù)合物，MyD88通過下游分子IRF-1誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抵御DTMUV的感染(圖2)[42-43]。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，DTMUV感染大腦和脾后2 h，TLR3表達(dá)量分別增加了28.54倍和1.57倍[44]。以上結(jié)果都表明，TLR3介導(dǎo)的信號(hào)通路是抑制DTMUV復(fù)制所必需的。RLR家族的3個(gè)成員RIG-I、MDA5和LGP2可在大多數(shù)的組織中表達(dá)，其作為細(xì)胞質(zhì)的受體能夠感應(yīng)并識(shí)別各種不同病毒的RNA，并激發(fā)下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生和抗病毒基因表達(dá)。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RIG-I和MDA5參與了宿主對(duì)DTMUV的天然免疫應(yīng)答[45-47]。通過研究證實(shí)，MAVS的過表達(dá)顯著降低了DTMUV的復(fù)制，而其敲除增加了DEF細(xì)胞中的病毒滴度，并且顯著降低了DTMUV誘導(dǎo)的IRF1、NF-κB和IFN-β的激活[48]。此外，利用LC-MS/MS對(duì)DTMUV感染鴨的卵泡蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量分析表明，RLR信號(hào)通路參與了DTMUV感染，在感染DTMUV的雛鵝中，RIG-I、MDA5、LGP2和干擾素基因刺激物(STING)在感染后5 d都顯著增加[49]。除了TLR和RLR外，其他PRRs包括NOD樣受體、胞漿DNA受體在應(yīng)對(duì)微生物感染方面也起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，DDX3X和DDX5在DTMUV感染的BHK21細(xì)胞中顯著減少，其中，DDX3X過表達(dá)通過TBK1蛋白調(diào)控IFN-Ⅰ抑制DTMUV的增殖，其結(jié)果與在其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)到的DDX5不同，表明鳥類和哺乳動(dòng)物對(duì)DTMUV的先天免疫應(yīng)答可能存在差異[50]。雖然DTMUV感染可能涉及多種PRRs，但目前僅關(guān)注這些PRRs的表達(dá)變化，其具體功能有待進(jìn)一步研究。

3.2 免疫逃避

在感染早期，真核生物依賴PRRs識(shí)別PAMPs到最終產(chǎn)生IFN-Ⅰ來抵御病原微生物入侵。研究已經(jīng)證實(shí)了DTMUV進(jìn)化出多種策略阻斷IFN-Ⅰ產(chǎn)生過程中的信號(hào)傳遞，包括阻斷病原的識(shí)別、操縱信號(hào)通路的關(guān)鍵分子、調(diào)控IFN-Ⅰ基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等(圖2)。MDA5和TLR3依賴的信號(hào)通路誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的表達(dá)，對(duì)抵御病毒的復(fù)制具有重要作用。DTMUV感染DEF細(xì)胞外分泌體中的miR-148a-5p可以靶向TLR3，下調(diào)IFN-β的表達(dá)，從而逃避宿主的天然免疫應(yīng)答[46]。研究還發(fā)現(xiàn)，DTMUV感染DEF細(xì)胞導(dǎo)致miR-148a-5p的下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致SOCS1表達(dá)的上調(diào)；同時(shí)，miR-221-3p的表達(dá)水平也出現(xiàn)上調(diào)，促使SOCS5表達(dá)的下調(diào)，兩種途徑均可抑制IFN-β的表達(dá)使病毒逃避宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)[46]。DTMUV的蛋白通過不同的策略抑制IFN產(chǎn)生，也是病毒逃逸宿主免疫反應(yīng)的重要途徑。DTMUV的NS1蛋白靶向MAVS，阻斷RIG-I/MDA5和MAVS的結(jié)合，顯著抑制病毒觸發(fā)的IFN-β的表達(dá)[22]。NS1蛋白的表達(dá)導(dǎo)致RPS7和MDM2的低表達(dá)，最終導(dǎo)致p53的高表達(dá)[24]。p53已被報(bào)道是抵抗大多數(shù)病毒(包括HIV-1、HCV、PEDV、FMDV和NDV等)復(fù)制的重要宿主限制因子，通過影響宿主細(xì)胞的周期阻滯、DNA修復(fù)、自噬、衰老和凋亡促進(jìn)病毒的感染，而p53的高表達(dá)對(duì)DTMUV復(fù)制的影響通路還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。DTMUV NS2A以劑量依賴的方式顯著抑制RIG-I、MDA5、MAVS、STING、TBK1誘導(dǎo)的IFN-β的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)病毒的感染。NS2A與TBK1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合STING，破壞依賴于STING的抗病毒細(xì)胞防御，為DTMUV抵御宿主天然免疫反應(yīng)的一種新的機(jī)制[45]。

圖2 DTMUV感染和病毒逃逸機(jī)制介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答模式圖[51]

4 DTMUV的診斷與防控

病毒分離與鑒定是診斷病毒性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，可利用病鴨的卵巢、脾及腦等組織，經(jīng)研磨、離心、過濾后接種雞胚/鴨胚，亦可用DEF、CEF、BHK-21、DF-1和Vero等細(xì)胞系進(jìn)行病毒的分離鑒定，其中，BHK-21細(xì)胞對(duì)DTMUV的分離率最高[52]。但該方法對(duì)于研究人員的操作技術(shù)要求較高，且成功率相對(duì)較低。自DTMUV暴發(fā)以來，已開發(fā)了大量病原學(xué)(RT-PCR、RT-qPCR、RT-LAMP及高通量測(cè)序等)[25,53-54]和血清學(xué)(ELISA、膠體金免疫層析及中和試驗(yàn)等)[55-58]的檢測(cè)方法，其中，RT-PCR為最廣泛的病原檢測(cè)方法，適用于流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷。SHERLOCK是Zhang團(tuán)隊(duì)基于Cas13a非特異RNA切割系統(tǒng)開發(fā)的一種快速、廉價(jià)、高靈敏度的新核酸診斷技術(shù)，以此開發(fā)的DTMUV檢測(cè)方法具有極大的應(yīng)用前景[59]。

自2010年DTMUV在我國暴發(fā)以來，已成為養(yǎng)鴨業(yè)的重要疾病，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫病防治的核心為“防重于治”，需從生物安全防控、飼養(yǎng)管理及養(yǎng)殖方式等多方面采取合理的防控措施控制疫病的傳播與擴(kuò)散。目前，疫苗免疫是DTMUV最重要的防控方式之一，研發(fā)的滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗均取得了良好的預(yù)防效果。DTMUV弱毒株的制備主要依靠細(xì)胞或禽胚上連續(xù)傳代致弱和使病毒毒力基因突變或者重組的基因工程方法。將DTMUV分離株FX2010在CEF細(xì)胞中連續(xù)傳代至P180，致弱毒株接種鴨群后能誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答，且能完全抵抗強(qiáng)毒株的攻擊，并已開發(fā)成為商品化弱毒苗[60]。而He等[61]使用從麻雀中分離到的DTMUV強(qiáng)毒株在SPF雞和鴨胚胎中交替?zhèn)鞔B續(xù)傳代至第70代，致弱毒株免疫雛鴨后具有極好的免疫原性和安全性，對(duì)DTMUV強(qiáng)毒株感染的保護(hù)率為100%。在滅活疫苗中添加IL-2比未添加的滅活疫苗可顯著增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞應(yīng)答，誘導(dǎo)的抗體水平更高，同時(shí)減少了接種抗原的劑量，可有效解決接種量大、免疫周期短、效果不完全等局限性[62]。DTMUV基因工程疫苗的研究主要集中在重組抗原疫苗、重組載體疫苗及DNA疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，DTMUV E蛋白的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ結(jié)構(gòu)域均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的截短的E蛋白能誘導(dǎo)雛鴨產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)，可抵抗DTMUV感染[19-21]?；蛑亟M載體疫苗具有安全性高、免疫原性好等特點(diǎn)。有學(xué)者利用重組腺病毒和沙門菌作為載體開發(fā)DTMUV重組載體疫苗，可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生高水平的中和抗體，產(chǎn)生100%的攻毒保護(hù)作用[63]。DNA疫苗也是DTMUV疫苗研究的熱點(diǎn)，雛鴨肌肉注射基于SFV復(fù)制子和DTMUV E蛋白的DNA疫苗后，所有免疫的雛鴨都產(chǎn)生了強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能抵抗DTMUV AH-F10強(qiáng)毒株的攻擊，為新型疫苗的開發(fā)提供了新的思路[64]。衣殼蛋白靶向滅活(CTVI)是一種概念上強(qiáng)大的新型抗病毒策略，它基于病毒衣殼蛋白與核酸酶的融合蛋白裝配到病毒粒子中，以破壞病毒DNA/RNA或干擾病毒關(guān)鍵蛋白的正確折疊。利用該策略發(fā)現(xiàn)，DTMUV衣殼融合蛋白可以在敏感的BHK21細(xì)胞中表達(dá)而不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，并且具有良好的鈣依賴核酸酶活性，可抑制TMUV的復(fù)制[65]。目前無特效的抗病毒藥物來對(duì)抗DTMUV感染，而利用降解病毒基因組是一種新的抗DTMUV基因療法。有學(xué)者基于DTMUVNS5基因構(gòu)建了重組腺病毒載體，其高效地抑制了DTMUV的增殖，并對(duì)病毒的抑制作用呈劑量依賴性[65]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Cas13b是一種利用RNA引導(dǎo)靶向和切割RNA分子的CRISPR酶，具有高度的特異性和靶向靈活性，已有報(bào)道在哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中抑制RNA病毒，可能在未來的抗RNA病毒治療中發(fā)揮積極的作用[66-68]。利用CRISPR/Cas13b系統(tǒng)構(gòu)建了靶向PRRSVORF5和ORF7基因的重組載體，在轉(zhuǎn)基因Marc-145細(xì)胞中顯示出很強(qiáng)的抑制效果，同時(shí)針對(duì)ORF5和ORF7基因的雙crRNA幾乎完全消除了病毒感染[66]，在基孔肯雅病毒的研究中也顯示出強(qiáng)大的抑制病毒增殖效果[69]。

5 展 望

自鴨坦布蘇病毒病疫苗上市以來，病毒的流行和傳播得到了有效的控制，但在全國主要的養(yǎng)鴨地區(qū)仍出現(xiàn)零星散發(fā)的情況。DTMUV基因組極易發(fā)生變異，在易感動(dòng)物的免疫壓力下發(fā)生重組變異，其對(duì)病毒的免疫原性、致病性和宿主感染譜均可能發(fā)生不同程度的改變。通過對(duì)DTMUV毒株全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，臨床上出現(xiàn)多株新的變異毒株，而現(xiàn)行的TMUV弱毒疫苗/滅活苗對(duì)變異毒株是否具有免疫保護(hù)力還未可知，需要進(jìn)一步的研究。因此，對(duì)DTMUV長(zhǎng)期進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及遺傳變異分析，為有效、快速地對(duì)DTMUV進(jìn)行防控極其重要。迄今為止，雖然人們對(duì)于DTMUV的病原學(xué)、流行特點(diǎn)及宿主天然免疫的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，但對(duì)病毒吸附受體作用詳細(xì)機(jī)理、不同組織中復(fù)制作用的變化情況、抗體干擾病毒的分子作用模式及其他影響機(jī)體免疫力的模式尚不完全清楚。此外，研究DTMUV的潛在宿主，徹底消滅潛伏的帶毒感染源，仍是人們所面對(duì)的難題，有待進(jìn)一步研究。