不同活體餌料對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育的影響*

張佳怡，周宇航，高 翔，劉 東，鞏 杰

（南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇226019）

斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因具有高度同源性，在生物學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、解剖學(xué)等諸多領(lǐng)域做出重要貢獻(xiàn)[1]，在中藥研究及各類(lèi)疾病研究中得到廣泛應(yīng)用[2-5]。如今將斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普遍養(yǎng)殖，斑馬魚(yú)幼體培養(yǎng)階段至關(guān)重要，選擇優(yōu)質(zhì)餌料十分關(guān)鍵。活體餌料可促進(jìn)斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)和性腺發(fā)育，縮短性腺成熟時(shí)間[6-7]，是斑馬魚(yú)主要食物來(lái)源。吳興兵等[7]分別使用豐年蟲(chóng)、冰凍輪蟲(chóng)、水蚯蚓和人工配合飼料作為開(kāi)口餌料對(duì)四川裂腹魚(yú)仔魚(yú)進(jìn)行投喂實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)豐年蟲(chóng)能保證仔魚(yú)較快生長(zhǎng)速度和較高成活率。草履蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)的無(wú)節(jié)幼體是目前實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的優(yōu)質(zhì)活體餌料[8-9]，但大多認(rèn)為豐年蟲(chóng)不適合作為斑馬魚(yú)幼體的開(kāi)口餌料，因?yàn)樵缙谟佐~(yú)的開(kāi)口小，難以攝取豐年蟲(chóng)。輪蟲(chóng)是大多數(shù)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)最優(yōu)質(zhì)的開(kāi)口餌料之一[10-12]，是否能作為斑馬魚(yú)幼體的開(kāi)口餌料值得探究。為了探究斑馬魚(yú)幼體更合理的餌料及投喂方式，本實(shí)驗(yàn)選擇草履蟲(chóng)、豐年蟲(chóng)和輪蟲(chóng)三種活體餌料，探究不同餌料及其組合對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期篩選出適宜斑馬魚(yú)幼體生長(zhǎng)的活體餌料，供實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖時(shí)餌料選擇參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：斑馬魚(yú)由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（蘇）2019-0001/SYXK（蘇）2017-0045］，使用野生型（AB）品種斑馬魚(yú)內(nèi)交產(chǎn)生后代進(jìn)行培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作在南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，符合江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)倫理規(guī)范，遵循3R原則，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)為20200711-001。

1.1.2 餌料來(lái)源：草履蟲(chóng)來(lái)自實(shí)驗(yàn)室培育，酵母粉經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培育斑馬魚(yú)所用水溶解并過(guò)濾后投喂；豐年蟲(chóng)為現(xiàn)孵現(xiàn)用，人工配置海水，于孵化器內(nèi)孵化干燥豐年蟲(chóng)卵24～36 h后，收集豐年蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體；輪蟲(chóng)為網(wǎng)上購(gòu)買(mǎi)活體，投喂小球藻和酵母進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：挑選受精后5天（5 dpf）活潑健康的野生型（AB）斑馬魚(yú)幼魚(yú)，隨機(jī)分為7組，饑餓組：不投喂任何食物；草履蟲(chóng)組：以足量草履蟲(chóng)作為餌料；輪蟲(chóng)組：以足量輪蟲(chóng)作為餌料；豐年蟲(chóng)組：以足量豐年蟲(chóng)作為餌料；草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組：以足量草履蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)作為餌料；輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組：以足量輪蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)作為餌料；輪蟲(chóng)+草履蟲(chóng)組：以足量草履蟲(chóng)和輪蟲(chóng)作為餌料。每組分為4組重復(fù)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：每個(gè)養(yǎng)殖容器中放養(yǎng)斑馬魚(yú)幼體20尾，加入400 mL實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)斑馬魚(yú)所用系統(tǒng)水（水溫28℃，電導(dǎo)率500～550 S/m，pH值7～7.5，硬度100 mg/L CaCO3，鹽度0.25～0.75 ppt）。每日于上午9：00，下午5：00喂食2次。將豐年蟲(chóng)和輪蟲(chóng)置于300目篩網(wǎng)上用系統(tǒng)水沖洗3 min，然后收集于燒杯中，用系統(tǒng)水稀釋后采用滴管投喂。每日下午7：00對(duì)飼養(yǎng)容器吸污，換水，換水量為150 mL，換水后觀察幼魚(yú)存活率及生長(zhǎng)情況。對(duì)投喂豐年蟲(chóng)組別（豐年蟲(chóng)組、草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組、輪蟲(chóng)+草履蟲(chóng)組），每日上午喂食2小時(shí)后觀察攝食豐年蟲(chóng)幼魚(yú)的數(shù)量（斑馬魚(yú)幼魚(yú)攝食豐年蟲(chóng)后腹部出現(xiàn)明顯紅或橙色），記錄攝食豐年蟲(chóng)幼魚(yú)的比例，直到全部幼魚(yú)開(kāi)始攝食豐年蟲(chóng)為止。每隔10天從各處理組隨機(jī)取3條幼魚(yú)，采用Leica QWin V3拍照，測(cè)量幼魚(yú)體長(zhǎng)。40 dpf天后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，測(cè)量各組每條魚(yú)的最終體長(zhǎng)和體質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同餌料對(duì)斑馬魚(yú)幼體存活率的影響 實(shí)驗(yàn)最開(kāi)始時(shí)各組存活率都較高，10 dpf后饑餓組斑馬魚(yú)幼體開(kāi)始大量死亡，至14 dpf幼魚(yú)全部死亡。草履蟲(chóng)組、草履蟲(chóng)+輪蟲(chóng)組10～12 dpf存活率有所下降，13～25 dpf幼魚(yú)死亡率無(wú)顯著增加，從26 dpf開(kāi)始存活率再次顯著下降。草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組10～14 dpf存活率有所下降，之后存活率始終保持高水平。單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組從11 dpf開(kāi)始出現(xiàn)明顯死亡，但34 dpf后直到試驗(yàn)結(jié)束未再出現(xiàn)死亡，最終存活率在7組中居第2位。輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組在9 dpf開(kāi)始出現(xiàn)死亡，最終存活率居豐年蟲(chóng)組之后。單獨(dú)投喂輪蟲(chóng)組從10 dpf開(kāi)始直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束持續(xù)存在死亡現(xiàn)象。添加豐年蟲(chóng)各組最終存活率分居前3位，高于未添加豐年蟲(chóng)各組。見(jiàn)圖1。

圖1 斑馬魚(yú)幼魚(yú)存活率

2.2 斑馬魚(yú)幼體攝食豐年蟲(chóng)情況 8 dfp前豐年蟲(chóng)組、草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組和輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組所有幼魚(yú)都無(wú)法攝食豐年蟲(chóng)，到9 dpf后3個(gè)組均出現(xiàn)能攝食豐年蟲(chóng)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，其中草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組中攝食豐年蟲(chóng)的幼魚(yú)比例最高，單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組次之，輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組最低。全部幼魚(yú)攝食豐年蟲(chóng)所需時(shí)間明顯不同，13 dpf時(shí)草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組所有幼魚(yú)攝食豐年蟲(chóng)，而單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組和輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組分別需要發(fā)育到22 dpf和20 dpf。見(jiàn)表1。

表1 斑馬魚(yú)幼魚(yú)攝食豐年蟲(chóng)比例（%）

2.3 不同活體餌料對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響 分別在5 dpf（實(shí)驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天）、20 dpf、30 dpf和40 dpf隨機(jī)對(duì)各處理組斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行拍照對(duì)比，圖2中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)魚(yú)的排列順序從左到右為草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組、輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組、豐年蟲(chóng)組、輪蟲(chóng)+草履蟲(chóng)組、草履蟲(chóng)組和輪蟲(chóng)組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組幼魚(yú)體長(zhǎng)相當(dāng)，隨著不同餌料的投喂，幼魚(yú)生長(zhǎng)速度出現(xiàn)顯著差異，投喂草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)的幼魚(yú)長(zhǎng)勢(shì)最好，體長(zhǎng)最長(zhǎng)，其次為投喂輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組以及單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組，未投喂豐年蟲(chóng)的3個(gè)組幼魚(yú)體長(zhǎng)顯著小于投喂豐年蟲(chóng)組，并且隨著幼魚(yú)不斷發(fā)育愈加明顯。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)成像

40 dpf后對(duì)各組存活的全部斑馬魚(yú)進(jìn)行體長(zhǎng)及體質(zhì)量測(cè)量，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)投喂輪蟲(chóng)組魚(yú)體體長(zhǎng)和體質(zhì)量最小，而草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組魚(yú)體生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于其他組，投喂豐年蟲(chóng)的3個(gè)組（豐年蟲(chóng)組、草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組、輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組）魚(yú)體體質(zhì)量和體長(zhǎng)均顯著高于未投喂豐年蟲(chóng)組（草履蟲(chóng)組、輪蟲(chóng)組、草履蟲(chóng)+輪蟲(chóng)組）。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 不同處理組斑馬魚(yú)幼魚(yú)平均體長(zhǎng)

為了探究不同餌料投喂對(duì)整個(gè)試驗(yàn)期間斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響，我們每隔10天測(cè)量各組幼魚(yú)體長(zhǎng)，結(jié)果10 dpf前所有投喂草履蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)組中幼魚(yú)生長(zhǎng)速度顯著高于未投喂草履蟲(chóng)組，單獨(dú)投喂草履蟲(chóng)組幼魚(yú)體長(zhǎng)增長(zhǎng)速度與同時(shí)投喂草履蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)組并無(wú)顯著差異。10 dpf后草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組、輪蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組以及豐年蟲(chóng)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)增長(zhǎng)速度顯著增加，增加速度明顯高于其它3組。同時(shí)，10 dpf后未投喂豐年蟲(chóng)的3組幼魚(yú)生長(zhǎng)速度顯著減慢，幾乎不再增長(zhǎng)。見(jiàn)圖5。

圖5 不同處理組斑馬魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)增長(zhǎng)曲線

3 討 論

圖4 不同處理組斑馬魚(yú)幼魚(yú)平均體質(zhì)量

饑餓是自然生態(tài)系統(tǒng)中影響水生動(dòng)物正常生長(zhǎng)、發(fā)育、存活的重要因素，充足的營(yíng)養(yǎng)對(duì)水生動(dòng)物尤其是小型變溫動(dòng)物的正常發(fā)育非常關(guān)鍵[13]。仔魚(yú)期階段是魚(yú)類(lèi)生活史中對(duì)環(huán)境條件最敏感、最脆弱時(shí)期，即使短時(shí)間的饑餓脅迫都能明顯延長(zhǎng)幼體的發(fā)育過(guò)程，并導(dǎo)致較高的死亡率[14]。仔魚(yú)孵化出膜后首先吸收卵黃內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，然而內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，若不能及時(shí)持續(xù)獲得食物，仔魚(yú)將達(dá)到饑餓不可逆點(diǎn)而死亡[15]。本實(shí)驗(yàn)中饑餓組斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)速度低于輪蟲(chóng)或草履蟲(chóng)投喂組，仍能發(fā)育到9 dpf，從10 dpf開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至15 dpf全部死亡；單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組9 dpf前未見(jiàn)進(jìn)食，部分幼魚(yú)從10 dpf開(kāi)始可以攝食豐年蟲(chóng)，死亡率顯著低于饑餓組。說(shuō)明斑馬魚(yú)幼魚(yú)在9 dpf前可通過(guò)吸收內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)完成生長(zhǎng)發(fā)育，之后內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已無(wú)法滿(mǎn)足生長(zhǎng)發(fā)育的需要。

褶皺臂尾輪蟲(chóng)適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快，營(yíng)養(yǎng)豐富，易于培養(yǎng)，游動(dòng)速度緩慢，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要地位，廣泛用作水產(chǎn)仔稚魚(yú)及蝦蟹甲殼類(lèi)的開(kāi)口餌料[10-12]。關(guān)于輪蟲(chóng)能否作為實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)幼魚(yú)優(yōu)質(zhì)開(kāi)口餌料的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管所用輪蟲(chóng)大小與實(shí)驗(yàn)室常用的草履蟲(chóng)相似，但投喂輪蟲(chóng)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡率較高，在投喂草履蟲(chóng)同時(shí)添加輪蟲(chóng)并不能提高幼魚(yú)存活率，對(duì)幼魚(yú)體長(zhǎng)和體質(zhì)量生長(zhǎng)無(wú)明顯促進(jìn)作用，無(wú)論是生長(zhǎng)前期還是后期相較于草履蟲(chóng)甚至豐年蟲(chóng)，都處于明顯劣勢(shì)。在四川裂腹魚(yú)餌料實(shí)驗(yàn)中也有類(lèi)似報(bào)道[16]。表明輪蟲(chóng)不適合作為斑馬魚(yú)等魚(yú)類(lèi)的開(kāi)口餌料。

在10 dpf前所有投喂草履蟲(chóng)各組幼魚(yú)體長(zhǎng)增速顯著快于未添加草履蟲(chóng)組，表明草履蟲(chóng)是斑馬魚(yú)幼魚(yú)早期的優(yōu)質(zhì)開(kāi)口生物餌料[17]。但從10 dpf開(kāi)始草履蟲(chóng)組和草履蟲(chóng)+輪蟲(chóng)組相較于投喂豐年蟲(chóng)各組幼魚(yú)體長(zhǎng)增速減慢，同時(shí)幼魚(yú)最終體長(zhǎng)、體質(zhì)量顯著低于豐年蟲(chóng)組，表明10 dpf后單一投喂草履蟲(chóng)已無(wú)法滿(mǎn)足幼魚(yú)生長(zhǎng)的需求，需要補(bǔ)充其他餌料（如豐年蟲(chóng)）才能滿(mǎn)足幼魚(yú)發(fā)育需要[10]。此外，一開(kāi)始保持較高存活率的草履蟲(chóng)組以及草履蟲(chóng)+輪蟲(chóng)組，從28 dpf開(kāi)始死亡率顯著增加，最終超過(guò)單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組，表明盡管草履蟲(chóng)可以作為斑馬魚(yú)幼魚(yú)開(kāi)口和早期適宜的餌料，但隨著幼魚(yú)不斷發(fā)育而逐步喪失優(yōu)勢(shì)，原因是由于草履蟲(chóng)為低營(yíng)養(yǎng)餌料，適用于魚(yú)類(lèi)幼體早期階段[18]，無(wú)法為后期幼魚(yú)提供存活所需的全部營(yíng)養(yǎng)。

豐年蟲(chóng)游動(dòng)速度適宜，便于魚(yú)類(lèi)捕食，且對(duì)魚(yú)體生存水環(huán)境無(wú)污染，可以滿(mǎn)足魚(yú)類(lèi)更高水平營(yíng)養(yǎng)的需求，其卵在常溫下長(zhǎng)期干燥保存，可隨時(shí)孵化使用，因而是實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)成魚(yú)或幼魚(yú)后期的重要餌料[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)斑馬魚(yú)幼魚(yú)也可正常發(fā)育，并且最終幼魚(yú)的存活率、體質(zhì)量和體長(zhǎng)顯著高于未投喂豐年蟲(chóng)組，但與投喂草履蟲(chóng)各組（草履蟲(chóng)組、草履蟲(chóng)+輪蟲(chóng)組和草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組）相比，單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組幼魚(yú)從12 dpf開(kāi)始出現(xiàn)大量死亡。此外，無(wú)論是豐年蟲(chóng)單獨(dú)投喂組還是豐年蟲(chóng)與輪蟲(chóng)或草履蟲(chóng)組合投喂組，斑馬魚(yú)幼魚(yú)都是在發(fā)育到9 dpf時(shí)才開(kāi)始攝食豐年蟲(chóng)。由于豐年蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體的體長(zhǎng)（約400微米）顯著大于草履蟲(chóng)和輪蟲(chóng)，斑馬魚(yú)幼魚(yú)在9 dpf前開(kāi)口小，無(wú)法完整攝食豐年蟲(chóng)。單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組死亡率高，是因?yàn)椴糠钟左w通過(guò)內(nèi)源性卵黃物質(zhì)無(wú)法生長(zhǎng)到能攝食豐年蟲(chóng)的大小而饑餓死亡，未死亡幼魚(yú)直至9 dpf或更晚才有外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入，但前期營(yíng)養(yǎng)不足對(duì)魚(yú)體已造成一定程度傷害，進(jìn)入不可逆生長(zhǎng)點(diǎn)而最終死亡[15]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在11 dpf時(shí)單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組中攝食豐年蟲(chóng)比例僅（39.6±10.0）%，而草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組為（92.2±4.1）%，當(dāng)幼魚(yú)發(fā)育到40 dpf時(shí)，單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組的幼魚(yú)平均體質(zhì)量顯著低于草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組，表明豐年蟲(chóng)盡管可以作為幼體時(shí)期唯一餌料，但存在一定的不足[19]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，10 dpf前單獨(dú)投喂草履蟲(chóng)組與同時(shí)投喂草履蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)組幼魚(yú)體長(zhǎng)增長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異，之后投喂草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)組以及單獨(dú)投喂豐年蟲(chóng)組相較于單獨(dú)投喂草履蟲(chóng)組，斑馬魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)增速顯著增加，表明10 dpf后豐年蟲(chóng)可作為主要餌料滿(mǎn)足斑馬魚(yú)營(yíng)養(yǎng)需求，相比于草履蟲(chóng)可以提供更加豐富和高級(jí)的營(yíng)養(yǎng)以供斑馬魚(yú)幼體生長(zhǎng)所需，采用草履蟲(chóng)+豐年蟲(chóng)投喂的斑馬魚(yú)幼體，其生長(zhǎng)占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。因此，在9 dpf前單一投喂草履蟲(chóng)，從9 dpf開(kāi)始添加豐年蟲(chóng)，13 dpf后可由豐年蟲(chóng)完全替代草履蟲(chóng)（此時(shí)幼魚(yú)能100%攝食豐年蟲(chóng)）是實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的最佳方式。