氣球菌的分類及臨床感染

周萬青， 谷盼盼， 沈 瀚*

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南京 210008)

氣球菌屬(Aerococcus)建立于1953年，隨著蛋白水平和分子技術(shù)的廣泛應(yīng)用，目前已有8個菌種歸屬該菌屬，分別為綠色氣球菌(A.viridans)[1]、脲氣球菌(A.urinae)[2]、柯氏氣球菌(A.christensenii)[3]、血氣球菌(A.sanguinicola)[4]、人脲氣球菌(A.urinaehominis)[5]、馬脲氣球菌(A.urinaeequi)[6]、豬氣球菌(A.suis)[7]和陰道氣球菌(A.vaginalis)[8]。氣球菌屬廣泛存在于空氣、土壤、植物、醫(yī)療環(huán)境中，是潛在的機會性感染病原菌。由該菌屬細(xì)菌造成的臨床感染報道越來越多[9-10]。而對于其分類學(xué)的研究也在不斷深入，雖然16S rRNA測序是該菌屬不同菌種的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，但在某些菌種的鑒別能力上仍存在缺陷[6]?，F(xiàn)有的生化鑒定，即便是應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)仍很難實現(xiàn)菌屬內(nèi)所有菌種的準(zhǔn)確鑒定[9-10]。臨床微生物檢驗迫切需要常規(guī)的生化鑒定、質(zhì)譜鑒定技術(shù)應(yīng)用于該類感染病原菌的菌種鑒定。而一直以來的錯誤鑒定造成該菌屬的檢出率被低估，使得在臨床上對該菌屬的關(guān)注度不高。因此，本文將從氣球菌屬的建立過程、各種鑒定技術(shù)在菌種鑒定上的優(yōu)勢、臨床感染類型、主要菌種的藥敏監(jiān)測數(shù)據(jù)以及指導(dǎo)臨床治療等方面進行闡述，以期為臨床診斷和診療提供參考。

1 種屬建立及鑒定

自1953年A.viridans菌種建立以來，先后已有8個菌種歸屬到氣球菌屬，菌種建立信息見表1。8個模式菌種分離自4種臨床患者樣本，動物來源樣本3種，環(huán)境來源樣本1種。該菌屬的GC含量為37.5%～47.6%，6株模式菌株已獲得全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)序列。其中6株有相關(guān)臨床感染報道[10]，畜牧養(yǎng)殖業(yè)動物也有報道[11-12]。

表1 氣球菌屬菌種的命名

1.1 表型特征

氣球菌屬在血瓊脂平板培養(yǎng)24 h后呈草綠色溶血、半透明的小菌落，與鏈球菌、腸球菌、片球菌等菌屬較難區(qū)別；革蘭染色顯微鏡觀察可見成雙、四聯(lián)或成簇狀革蘭陽性球菌，可與上述易混淆菌屬鑒別；該菌屬觸媒陰性、氧化酶陰性，需氧、微需氧條件下，6.5 g/L NaCl均可生長。

1.2 生化鑒定

氣球菌屬菌種主要通過API、Vitek 2、BBL-Crystal-GP鑒定系統(tǒng)等進行鑒定。在脲氣球菌的鑒定上API系統(tǒng)和BBL-Crystal-GP優(yōu)于Vitek 2系統(tǒng)[9]；而上述系統(tǒng)對于綠色氣球菌的鑒定結(jié)果較多，屬內(nèi)血氣球菌也可被鑒定為綠色氣球菌[13]；本科室分離馬脲氣球菌經(jīng)現(xiàn)有API和Vitek 2生化鑒定系統(tǒng)也被鑒定為綠色氣球菌[14]。現(xiàn)階段API 20 Strep和Vitek 2 Compact GP鑒定系統(tǒng)中僅包括綠色氣球菌和脲氣球菌鑒定數(shù)據(jù)庫，缺乏其他菌種數(shù)據(jù)。因此，對于商品化鑒定系統(tǒng)在屬內(nèi)菌種的鑒別上還有待數(shù)據(jù)庫的擴充，以實現(xiàn)屬內(nèi)各菌種的準(zhǔn)確鑒定。其中亮氨酸氨基肽酶、焦谷氨酸芳酰胺酶在菌屬內(nèi)各菌種的辨別具有重要指向性[1-8]，例如綠色氣球菌上述2個反應(yīng)結(jié)果為-+，而脲氣球菌則為+-，見表2。但現(xiàn)行商品化鑒定系統(tǒng)所采用的模式菌株個別生化反應(yīng)可能與臨床菌株生化反應(yīng)存在差異，從而也可能造成菌種鑒定的不同。因此對于生化反應(yīng)為基準(zhǔn)的鑒定仍需要其他鑒定技術(shù)的驗證。

表2 氣球菌屬菌種主要生化反應(yīng)[1-8]

1.3 質(zhì)譜鑒定

蛋白水平的鑒定可規(guī)避不同分離株間分解化合物的差異性，在菌種鑒定上具有很好的應(yīng)用。目前商品化質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)中進口品牌主要為布魯克和梅里埃，當(dāng)然也出現(xiàn)了國產(chǎn)品牌。兩家進口質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中均包括綠色氣球菌和脲氣球菌2個種[15]。據(jù)研究顯示，布魯克公司質(zhì)譜可實現(xiàn)血氣球菌的準(zhǔn)確鑒定[16]。而由于數(shù)據(jù)庫的缺陷，仍無法實現(xiàn)其他菌種準(zhǔn)確鑒定。

1.4 分子鑒定

16S rRNA序列分析一直被認(rèn)為是細(xì)菌菌種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但對氣球菌屬馬脲氣球菌16S rRNA分析時發(fā)現(xiàn)，其與綠色氣球菌間存在兩個堿基差異[6]；而本科室臨床分離到的馬脲氣球菌的核酸序列分析顯示，其與綠色氣球菌只存在一個堿基的差異[14]。根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Insitute,CLSI) MM18文件對于種屬的鑒別標(biāo)準(zhǔn)[17]，其比對符合率未達到種的鑒別，僅能確定為屬水平。因此，16S rRNA在鑒別綠色氣球菌和馬脲氣球菌中有一定的局限。核酸雜交(DNA-DNA hybridization，DDH)是菌種鑒定最為經(jīng)典的方法，但操作繁瑣，一般實驗室無法實現(xiàn)。而基于WGS的應(yīng)用，衍生出很多類似的核酸比對技術(shù)，例如平均核酸一致性分析(average nucleotide identity，ANI)技術(shù)可實現(xiàn)DDH的鑒別功能[18]。通過對臨床分離的馬脲氣球菌進行ANI分析，更好地確定了臨床分離菌株的菌種信息[14]。目前已有6個模式菌株的WGS序列可在網(wǎng)絡(luò)查詢[19]，一些臨床菌株的WGS序列也在不斷地擴充該菌屬的WGS數(shù)據(jù)庫[14，20-21]。

2 臨床感染

氣球菌屬可造成人類多個部位感染，臨床分離到的常見菌種為脲氣球菌、綠色氣球菌、血氣球菌等，可引起尿路感染、血流感染、心內(nèi)膜炎、骨和關(guān)節(jié)感染、軟組織感染、腦膜炎、腹膜炎、膿腫等[9-10]。一些菌種也是動物感染的機會病原菌，例如綠色氣球菌引起牛乳腺炎、豬關(guān)節(jié)炎、豬腦膜炎、豬肺炎等[11-12]。在臨床感染報道中，常見的為尿路感染和心內(nèi)膜炎。調(diào)查顯示，脲氣球菌致尿路感染的分離率在0.31%～0.44%，每年其致血流感染率為3人/1 000 000人；血氣球菌每年致血流感染率為1.4人/1 000 000人[9-10]。

2.1 尿路感染

大量報道顯示氣球菌屬菌株可引起臨床患者尿路感染，確切的感染數(shù)量可能因目前的生化等鑒定技術(shù)的不足而被低估。因此，仍需提高該類細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。脲氣球菌、綠色氣球菌、血氣球菌等均可造成患者尿路感染[9-10，15，22]，老年女性有基礎(chǔ)尿路障礙的患者居多。對于一些無癥狀患者的檢出，提示該菌屬可能存在一定的定殖，在一定條件下可引起患者的感染[15]。

2.2 感染性心內(nèi)膜炎

研究發(fā)現(xiàn)，氣球菌屬可引起患者嚴(yán)重的侵襲性感染，其中心內(nèi)膜炎最為多見。患者年齡一般超過65歲(平均年齡72歲)，并伴有基礎(chǔ)尿路感染，極少數(shù)感染患者的年齡小于42歲[23]。脲氣球菌和血氣球菌可引起有尿路疾患的老年患者繼發(fā)性心內(nèi)膜炎[9，24]。

3 藥敏試驗及監(jiān)測數(shù)據(jù)

2016年之前，檢出的氣球菌屬菌株進行藥敏結(jié)果判斷多以草綠色鏈球菌的判斷折點為依據(jù)。隨著該類細(xì)菌感染檢出數(shù)量的遞增，對該菌屬引起感染的認(rèn)識也逐漸加強 ，基于現(xiàn)有的監(jiān)測手段和治療經(jīng)驗，CLSI[25]和歐洲藥敏試驗聯(lián)合委員會(The European Commitlee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)[26]分別在2016年和2017年對其中個別菌種的藥敏試驗及判斷進行了文件規(guī)定。CLSI M45-A3文件中對氣球菌屬3個種(脲氣球菌、綠色氣球菌和血氣球菌)對青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、美羅培南、萬古霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、復(fù)方磺胺、利奈唑胺藥物最小抑菌濃度(Minimum inhibitory Concentration,MIC)方法判斷折點，需基于添加馬血并調(diào)節(jié)陽離子的MH肉湯培養(yǎng)基進行藥敏試驗。建議青霉素、頭孢曲松和萬古霉素為首要檢測藥物，尤其建議對分離自無菌部位(血液、深部組織)，特別對分離自免疫缺陷患者樣本中的菌株進行檢測。EUCAST文件也在2017年對氣球菌屬中的血氣球菌和脲氣球菌進行了折點設(shè)定。

臨床報道較多的菌種及藥敏監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，絕大多數(shù)氣球菌對β內(nèi)酰胺類藥物敏感[13，27-34]。例如脲氣球菌和血氣球菌對青霉素和阿莫西林的MIC50在0.032 g/mL以下；對頭孢他定的MIC50在0.25 g/mL以下；對喹諾酮類如左氧氟沙星的MIC50分別在0.5 g/mL和1 g/mL以下；對萬古霉素、利奈唑胺敏感；脲氣球菌對復(fù)方磺胺類藥物的MIC存在一定的差異性，可能與藥敏試驗方法的差異或者培養(yǎng)基成分的差異性有關(guān)。雖然大多數(shù)菌種對β內(nèi)酰胺類藥物敏感，但在綠色氣球菌中已出現(xiàn)青霉素不敏感臨床分離報道，需要引起重視。大范圍藥敏監(jiān)測數(shù)據(jù)[13，27-34]見表3和表4。

表3 脲氣球菌藥敏監(jiān)測數(shù)據(jù)

表4 血氣球菌藥敏監(jiān)測數(shù)據(jù)

監(jiān)測結(jié)果表明較多的分離于尿路的脲氣球菌和血氣球菌，其對喹諾酮類藥物的敏感度較高[13，28，31-32]，可經(jīng)驗性選用；雖然磷霉素的MIC50為8 g/mL[31]，但鑒于該類藥物特殊的分布特點仍可選用；對復(fù)方磺胺類藥物檢測結(jié)果的差異性[33]，可能與檢測方法和培養(yǎng)基中的成分有很大關(guān)系。提示進行臨床藥敏試驗時，必須采用統(tǒng)一的方法和培養(yǎng)基，這樣其結(jié)果才具可比性。對于脲氣球菌引起的非復(fù)雜性尿路感染，呋喃妥因和磷霉素是很好的選擇[9，31]，對復(fù)雜性尿感，可選擇阿莫西林和喹諾酮類進行治療[9]。對血氣球菌引起的尿路感染，經(jīng)驗性藥物選擇不考慮呋喃妥因和磷霉素，阿莫西林可能是較好的選擇。上述觀點還需要更多的臨床數(shù)據(jù)支持[9]。感染性心內(nèi)膜炎患者首選藥物為青霉素，可聯(lián)合氨基糖苷類。青霉素聯(lián)合氨基糖苷無論是體外協(xié)同試驗還是一些臨床治療結(jié)果，均顯示具有較好的協(xié)同作用[9]。

對氣球菌屬耐藥機制的研究也在不斷進行中。例如喹諾酮類耐藥基因gyrA、gyrB、gyrC、pacE及突變與菌株耐藥相關(guān)性研究等[32]。糖肽類抗生素作為革蘭陽性球菌的最后防線，同樣也適用于氣球菌屬。一些案例報道萬古霉素非敏感氣球菌菌種和菌株的檢出[11，35]。據(jù)推測，上述耐藥菌株可能為馬脲氣球菌。由于馬脲氣球菌臨床感染報道很少，人們對于該菌的認(rèn)識不足，2005年該菌由馬脲片球菌重新歸類為馬脲氣球菌[6]，該菌對糖肽類抗生素應(yīng)為天然耐藥，這已經(jīng)在臨床分離菌株中得到證實[14]，但還需更多數(shù)據(jù)的支持。

4 毒力及致病性

造成心內(nèi)膜炎的病原菌大多可形成生物膜。對心內(nèi)膜炎患者血流檢出的脲氣球菌研究顯示，該菌可在體外形成生物膜，而且當(dāng)人類血漿存在時，生物膜形成更為顯著[36]。生物膜的形成可有效抵抗抗生素的滲透治療。研究還顯示，這些感染患者一般在之前有導(dǎo)尿管插管經(jīng)歷，因此，導(dǎo)尿管處的細(xì)菌定殖或生物膜形成是造成后續(xù)血流感染的危險因素[23]。研究發(fā)現(xiàn)脲氣球菌對人類血小板具有聚集誘導(dǎo)和激活功能，更加驗證了感染性心內(nèi)膜炎患者致病機制中血小板凝集的作用[36]。深入研究顯示，脲氣球菌可通過補體系統(tǒng)激活、纖維蛋白原和IgG分子依賴的途徑激活血小板[36]。相似的研究在血氣球菌也有發(fā)現(xiàn)[34]。借助WGS的應(yīng)用，對于菌株毒力基因的研究也在不斷深入。通過WGS數(shù)據(jù)中細(xì)菌黏附相關(guān)基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，血氣球菌和脲氣球菌基因組中均存在一些毒力基因(htpB、lmb、ilpA)[21]。表達莢膜多糖抗原是細(xì)菌抵抗免疫吞噬的毒力因子。在綠色氣球菌菌株中發(fā)現(xiàn)莢膜多糖的存在；相對于無毒力菌株，有毒力的綠色氣球菌具有較高水平的Hsp60分子的表達[21]。通過WGS預(yù)測比對分析，發(fā)現(xiàn)血氣球菌和脲氣球菌基因組中均存在莢膜多糖抗原成分[21]，這對于后續(xù)菌株毒力相關(guān)研究提出一個全新的研究思路。

5 菌株克隆研究

氣球菌菌株克隆研究的技術(shù)方法包括16S rRNA序列分析、Rep-PCR技術(shù)、RAPD、PFGE技術(shù)，以及基于WGS數(shù)據(jù)的進化分析。采用Rep-PCR技術(shù)[37]或PFGE技術(shù)[1，38]對臨床分離氣球菌菌株進行克隆分析，數(shù)據(jù)顯示臨床分離菌株具有遺傳多樣性。因此，提示氣球菌造成的臨床感染仍為散發(fā)性，并未造成克隆播散性感染。

6 展 望

隨著臨床氣球菌的不斷分離，以及對于該菌屬菌種鑒定技術(shù)的不斷提升，人們越來越認(rèn)識到該菌屬臨床感染的重要性，但由于鑒定技術(shù)的不足，急需改善鑒定技術(shù)中的缺陷，擴充鑒定數(shù)據(jù)庫使其更加完整，為臨床準(zhǔn)確鑒定提供支持。更多規(guī)范化藥敏試驗和數(shù)據(jù)的積累，為更好地指導(dǎo)臨床經(jīng)驗性用藥至關(guān)重要。認(rèn)識和理解細(xì)菌毒力基因及其致病性，為更好地預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)，尤其對于氣球菌造成的心內(nèi)膜炎和尿路感染的治療。全基因組測序技術(shù)的應(yīng)用為上述研究提供精準(zhǔn)的基因分析。雖然目前氣球菌造成的臨床感染為散發(fā)性，但仍不可忽視其造成播散性感染的可能。因此，需盡快實現(xiàn)該類菌的準(zhǔn)確鑒定并加強藥敏監(jiān)測力度，深入研究其致病機制，為臨床診療提供數(shù)據(jù)參考。