木賊鐮孢基因功能注釋及比較基因組學(xué)分析

李雪萍， 許世洋， 范雨軒， 汪學(xué)苗， 張怡忻， 李敏權(quán)*

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

木賊鐮孢(Fusariumequiseti(Corda)Sacc.)是一種功能復(fù)雜的真菌，有性時(shí)期為錯(cuò)綜赤霉(GibberellaintricansWollenw.)，其寄主廣泛，致病性強(qiáng)，是多種植物的病原[1-3]。近年來其危害逐漸加重，能侵染小麥、玉米、大麥、燕麥、黑小麥等多種作物，引起小麥冠腐病、根腐病和莖基腐病[4]，玉米鞘腐病[5]、穗腐病[6]，水稻立枯病[7]等。木賊鐮孢也能侵染馬鈴薯、蘆筍、豇豆、番茄、洋蔥、豌豆、蠶豆、鷹嘴豆、大頭菜、布什豆、油菜、甜瓜等蔬菜瓜果類作物[8]，導(dǎo)致豇豆、大豆根腐病[9-10]、萵苣葉斑病[11]、甜瓜枯萎病[12]、向日葵枯萎病[13]、青棗腐爛病[14]及蘿卜苗期葉部病害[15]等。此外，木賊鐮孢還能引起諸如小茴香枯萎病[16]、五味子莖基腐病[17]、魚尾葵褐斑病[18]、桑樹桑疫病[19]、大花蕙蘭及苜蓿根腐病[20-21]等一些花草樹木及中藥材的病害。木賊鐮孢之所以能使多種不同作物感病，多是因?yàn)槠淇梢援a(chǎn)生一些毒素[22]。而這些毒素的產(chǎn)生、調(diào)控機(jī)制及如何危害植物，都需要找出具體的原因。ukasz等[23]通過分析木賊鐮孢tef-1α序列產(chǎn)生毒素的基因，發(fā)現(xiàn)來自ZEA合成途徑的2個(gè)聚酮體合成酶的基因PKS13和PKS4，以及來自單端孢霉烯合成途徑的TRI5基因。但僅進(jìn)行小片段的序列分析難以找出更多相關(guān)的調(diào)控基因。目前，全基因組測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成熟，如通過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了大腸埃希菌(E.coli)O104∶H4編碼志賀毒素的stx2基因[24]、豬鏈球菌基因組中存在一個(gè)89 kb的毒力島[25]、Ⅱ型糖尿病人易感基因[26]、3個(gè)與大腸埃希菌細(xì)胞分裂直接相關(guān)的基因[27]、蘋果滇楸葉斑病的抗性基因[28]等。由此可見，通過全基因組測序能深入理解病原的作用機(jī)制、耐藥基因和致病基因的傳播規(guī)律、植物與病原的互作機(jī)制等，從而解決病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的各種問題。前期研究中，基于Illumina Hiseq 4000和PacBio平臺對木賊鐮孢D25-1的全基因組進(jìn)行從頭測序、組裝分析、提交至NCBI，Illumina平臺的測序結(jié)果在DDBJ/ENA/GenBank數(shù)據(jù)庫的注冊號為QJGT00000000，PacBio平臺的組裝結(jié)果在DDBJ/ENA/GenBank數(shù)據(jù)庫的注冊號為QOHM00000000。在此基礎(chǔ)上，本研究對其基因功能進(jìn)行全面的注釋，找出產(chǎn)毒基因，并進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，為木賊鐮孢甚至鐮孢菌屬功能基因的挖掘以及致病機(jī)理的研究、抗生素藥物開發(fā)和相應(yīng)病害控制策略的建立提供切實(shí)有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因組基本信息 木賊鐮孢D25-1基因組大小為40 776 005 bp，組裝得到16個(gè)Contig，最長Contig為8 344 890 bp，最短Contig為2 316 bp，GC含量為48.01%，見表1。在NCBI中選取能引起根腐病的外屬病原麥根腐平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)，同屬病原燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)、假禾谷鐮孢(Fusariumpseudograminearum)、茄病鐮孢(Nectriahaematococca)5 個(gè)菌株作為參考，與木賊鐮孢D25-1的全基因組序列進(jìn)行比較分析，基本信息如表2所示。

表1 木賊鐮孢D25-1的組裝信息

表2 基因組基本信息

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑與儀器 50 g/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich，CAS：17924-92-4)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZHLY-50，上海知楚儀器有限公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(Biosafer900-92，Biosafer)；液相色譜儀(Agilent 1200，Agilent)。

1.2 方法

1.2.1 基因功能注釋 基于氨基酸序列進(jìn)行基因功能注釋。使用BLAST軟件將木賊鐮孢D25-1待測基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與Gene Ontology (GO)[29]、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)[30]、Cluster of Orthologous Groups of proteins(COG)[31]、EggNOG[32]、NR、Antibiotic Resistance Genes Database(ARDB)、Carbohydrate-Active enZYmes Database (CAZy)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到相應(yīng)的功能注釋信息。

1.2.2 產(chǎn)毒基因進(jìn)化分析 鐮孢屬可產(chǎn)生多種毒素，主要包括玉米赤霉烯酮、單端孢霉毒素、串珠鐮刀菌素和伏馬菌素等[33]?；?.2.1基因注釋結(jié)果，從中尋找產(chǎn)毒相關(guān)基因，將其序列與GenBank中收錄的序列進(jìn)行比對，運(yùn)用Mega1.7.9構(gòu)建基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 玉米赤霉烯酮分泌規(guī)律測定 將木賊鐮孢D25-1接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，25 ℃，120 r/min搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，從第5天起每天定時(shí)抽取培養(yǎng)液，HPLC法檢測其玉米赤霉烯酮含量，檢測方法依據(jù)國標(biāo)GB5009.209-2016[34]。色譜條件：①色譜柱：C18柱，柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度4 μm；②流動相：V(乙睛)∶V(水)∶V(甲醇)=46∶46∶8；③流速：1.0 mL/min；④波長：檢測波長274 nm，發(fā)射波長440 nm；⑤進(jìn)樣量：100 μL；⑥柱溫：室溫。

1.2.4 比較基因組學(xué)分析 首先取參考菌株的基因集為Reference基因集，選取目標(biāo)菌株Query基因集與Reference基因集進(jìn)行BLAST比對；根據(jù)比對的長度與Identity值過濾比對結(jié)果，然后分別計(jì)算Reference與Query中每個(gè)基因的覆蓋比率BCR值(The Blast Coverage Ratio)。Reference與Query基因的BCR值計(jì)算公式[35]：BCR(Ref)=(Match/Length(R))×100%；BCR(Que)=(Match/Length(Q))×100%；其中Match為二者比對有效長度；Length (R)為Reference基因長度；Length (Q)為Query基因長度。最后根據(jù)設(shè)定的閾值確定泛基因(Pan基因)和共有基因(Core基因)。使用Treebest 1.9.2的PHYML(最大似然法)算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstraps參數(shù)設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因功能注釋

由表3可知，通過與各數(shù)據(jù)庫BLAST比對分析，被注釋的基因達(dá)13 134個(gè)，占總基因數(shù)的94.97%。其中NR數(shù)據(jù)庫、NOG數(shù)據(jù)庫、IPR數(shù)據(jù)庫的注釋條數(shù)較多為70%以上；病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫(PHI)注釋到1 422個(gè)基因，占10.28%。

表3 總體注釋情況

如圖1所示，通過KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫對木賊鐮孢D25-1基因組的注釋結(jié)果表明，其基因功能總體可分為6類，包括細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、基因信息處理、人類疾病、新陳代謝和有機(jī)系統(tǒng)。其中與細(xì)胞過程有關(guān)的功能基因有4種，共590條；與環(huán)境信息處理有關(guān)的功能基因有3種，共310條；與基因信息處理有關(guān)的功能基因有4種，共861條；與人類疾病有關(guān)的功能基因有12種，共791條；與新陳代謝有關(guān)的功能基因有12種，共3 781條；與有機(jī)系統(tǒng)有關(guān)的功能基因有10種，共569種。結(jié)果表明，與新陳代謝有關(guān)的功能基因的種類和豐度最高。

圖1 KEGG功能注釋分類Fig.1 KEGG annotations classification

2.2 產(chǎn)毒基因分析

基于2.1的注釋結(jié)果對產(chǎn)毒基因進(jìn)行挖掘。發(fā)現(xiàn)2個(gè)與玉米赤霉烯酮相關(guān)的基因，分別為D25-1_GLEAN_10000531和D25-1_GLEAN_10000533。D25-1_GLEAN_10000531與玉米赤霉烯酮合成過程中非還原迭代I型聚酮合成酶相關(guān)；D25-1_GLEAN_10000533與玉米赤霉烯酮合成過程中高度還原迭代I型聚酮合成酶相關(guān)(表4)。

表4 與玉米赤霉烯酮有關(guān)的基因

2.3 玉米赤霉烯酮合成酶基因進(jìn)化分析

將木賊鐮孢D25-1基因組中與分泌玉米赤霉烯酮有關(guān)的功能基因D25-1_GLEAN_10000531和D25-1_GLEAN_10000533分別命名為ALM1和ALM2。將其序列提交至NCBI獲得的登錄號分別為ALM1(MT038378)和ALM2(MT038379)。如圖2所示，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ALM1與玉米赤霉烯酮合成過程中非還原迭代I型聚酮合成酶的遺傳距離為0，自展支持率為100；ALM2基因與玉米赤霉烯酮合成過程中高度還原迭代I型聚酮合成酶的遺傳距離為0，自展支持率為100；均確定為玉米赤霉烯酮合成酶基因。

圖2 木賊鐮孢D25-1 ALM1和ALM2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Fusarium equiseti D25-1 ALM1 and ALM2 genes

2.4 玉米赤霉烯酮分泌規(guī)律

如圖3 HPLC檢測結(jié)果所示，在木賊鐮孢D25-1的代謝產(chǎn)物中檢測到玉米赤霉烯酮，培養(yǎng)第5～8天時(shí)玉米赤霉烯酮分泌量較大，呈指數(shù)增長。從第9天開始，玉米赤霉烯酮的含量達(dá)到40 μg/L以上，并趨于平穩(wěn)。

圖3 木賊鐮孢D25-1分泌玉米赤霉烯酮規(guī)律Fig.3 Regulation of Zearalenone secretion by Fusarium equiseti D25-1a、b、c、d、e表示在5%水平上差異顯著性，字母不同表示差異顯著a,b,c,d,e represents the significance of the difference at the 5% level，different letters indicate significant differences

2.5 比較基因組學(xué)分析

6株菌的Core基因共有7 378個(gè)，總長為3 821 847個(gè)堿基。Pan基因24 332個(gè)，總長為9 094 975個(gè)堿基，是Core基因和非必需基因的總和(表5)。隨著菌株數(shù)的增加，Core基因數(shù)的變化幅度降低，共有基因數(shù)趨于穩(wěn)定(圖4)。隨著菌株數(shù)增多，Pan基因數(shù)變多，變化幅度降低，6株菌的 Pan基因數(shù)目在24 000以上(圖5)。

表5 Core Pan基因統(tǒng)計(jì)表

圖4 Core 基因盒圖Fig.4 Core gene box figurei

圖5 Pan 基因盒圖Fig.5 Pan gene box figure

基于CorePan分析結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，木賊鐮孢D25-1與假禾谷鐮孢遺傳距離最近，其次是燕麥鐮孢，與麥根腐平臍蠕孢的遺傳距離最大(圖6)。

圖6 木賊鐮孢D25-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 The phylogenetic tree of Fusarium equiseti D25-1

3 討 論

本研究通過14個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋到木賊鐮孢D25-1的功能基因13 134個(gè)，占全基因組94.97%，注釋結(jié)果全面良好，有多個(gè)基因與木賊鐮孢細(xì)胞過程、新陳代謝、分子功能、致病性相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮合成酶相關(guān)的產(chǎn)毒基因2個(gè)。玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一種重要的真菌毒素，又稱 F-2毒素，多由鐮孢菌產(chǎn)生，其污染范圍廣，污染率高[36]，在霉變的玉米、小麥、高粱、燕麥、小米等谷類作物、花生等油料作物及其農(nóng)副產(chǎn)品(如飼料和加工食品等)中檢出率高[37-39]。其性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，有類雌激素的作用，通過糧食加工產(chǎn)品或畜產(chǎn)品食入動物或人體內(nèi)，會造成人和家畜生殖激素分泌紊亂，破壞生殖系統(tǒng)，造成畸形、流產(chǎn)、死胎等生殖疾病[40]。此外，玉米赤霉烯酮還具有免疫毒性[41]、細(xì)胞毒性[42]、遺傳毒性[43]、肝毒性等毒性作用[44]，可以降低人畜免疫力，引起肝腎功能衰退紊亂、基因突變等，甚至誘發(fā)癌變[45]。由此可見，玉米赤霉烯酮不但污染農(nóng)作物，造成生產(chǎn)上的損失，而且還會隨著食物進(jìn)入食物鏈，對人畜健康造成巨大的威脅。因此，應(yīng)加強(qiáng)對玉米赤霉烯酮相關(guān)基因及調(diào)控機(jī)理的研究，從根本上阻斷玉米赤霉烯酮的污染。

本研究通過對木賊鐮孢全基因組注釋、系統(tǒng)進(jìn)化分析及產(chǎn)玉米赤霉烯酮規(guī)律的測定，確認(rèn)兩個(gè)與玉米赤霉烯酮合成酶相關(guān)的基因，但其基因功能驗(yàn)證及調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。在植物病原真菌方面，禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、輪枝鐮孢(Fusariumverticillium)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、Eremotheciumgossypii、Magnaporthegrisea、Nectriahaematococca、Ustilagomaydis全基因組均已測序完成，為相應(yīng)的病害控制策略研究以及抗生素藥物開發(fā)等提供了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究通過比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)木賊鐮孢與假禾谷鐮孢遺傳距離最近，其次是燕麥鐮孢。目前數(shù)據(jù)庫中關(guān)于鐮孢菌的產(chǎn)毒基因及全基因組數(shù)據(jù)相對較少，因此，某個(gè)基因具體的功能和作用機(jī)制還有賴于后基因組學(xué)的研究及驗(yàn)證，分類地位也可能會隨數(shù)據(jù)庫中全基因組數(shù)據(jù)信息量的不斷擴(kuò)增而發(fā)生變化。