宿主感染馬紅球菌的免疫機制

馮婷婷， 徐兆坤， 郝秀靜， 張 穎， 李 敏*， 羅海霞*

(1．寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2．寧夏大學 生命科學學院，寧夏 銀川 750021)

馬紅球菌(Rhodococcusequi)，作為一種人獸共患病原菌[1]，主要引起3～6月齡馬駒亞急性或慢性膿腫性支氣管肺炎，致死率高達80%以上[2]。作為一種人體機會性致病菌，馬紅球菌主要感染免疫缺陷患者，其中約80%的臨床特征表現(xiàn)為肺部疾病，病死率超過50%[3]。此外，馬紅球菌還可以感染豬、羊、貓、狗、駱駝等其他動物[4-8]。馬紅球菌感染后，其通過抑制吞噬體/自噬體與溶酶體的融合從而抵抗巨噬細胞的殺傷，導致肺部組織的破壞以及中性粒細胞大量涌入，最終發(fā)展為壞死性肺炎[9]。目前針對馬紅球菌肺炎的防治尚無有效疫苗可以使用，只能使用抗生素進行聯(lián)合治療，但由于耐藥菌株的出現(xiàn)使得馬紅球菌肺炎的防治面臨更艱難的挑戰(zhàn)[10]。因此，研究馬紅球菌與宿主免疫細胞的相互作用對于探索該菌的致病機制非常重要。本文就宿主感染馬紅球菌的免疫機制進行概述，旨在為該菌所引發(fā)疾病的防治策略提供參考。

1 馬紅球菌及其感染

馬紅球菌屬放線菌目、諾卡菌科、紅球菌屬。該菌是一種革蘭陽性兼性胞內(nèi)寄生菌，菌落為粉色或黃色(圖1),棒狀或球形，耐酸，無孢子，大多無鞭毛，但有些菌株有菌毛或附肢。馬紅球菌的細胞壁具有疏水性且被多糖莢膜所圍繞(圖2)，其細胞壁的主要成分為富含霉菌酸(Mycolic acids)的脂質和脂多糖，其中脂多糖為海藻糖二甲酸酯(Trehalose dimycolate，TDM)和脂阿拉伯糖甘露聚糖(Lipoarabinomannans，LAM)[11-13]。從被感染的動物體內(nèi)分離到的致病性馬紅球菌均攜帶1個80～85 kb大小且具有宿主特異性的毒力質粒[14]。毒力質粒按功能可分為致病島、復制島和共軛島。馬紅球菌的致病性主要表現(xiàn)在其毒力質粒致病島上毒力基因所編碼的毒力相關蛋白(Virulence associate protein，Vaps)。研究發(fā)現(xiàn)，vap家族基因的表達受溫度、pH、氧化應激、鎂離子以及鐵離子等外界因素的調控。同時，VirR/VirS雙組分調節(jié)系統(tǒng)也控制vapA及致病島上其他基因的表達[15]。

圖1 LB固體培養(yǎng)基上馬紅球菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of R.equi on LB solid medium

圖2 馬紅球菌的透射電鏡下的超微結構形態(tài)[25]Fig.2 Ultrastructural morphology of R.equi in electron microscopy[25]

馬紅球菌廣泛存在于土壤中，同時也可以在草食動物糞便和大腸中繁殖，通過糞口途徑在農(nóng)場棲息地中傳播，該菌感染的主要宿主為3～6月齡馬駒和免疫缺陷患者，同時，還可以感染豬、羊、貓、狗、駱駝等其他動物。馬駒感染早期的臨床癥狀表現(xiàn)為輕度發(fā)燒或呼吸頻率增加，發(fā)展為肺炎時，表現(xiàn)為食欲下降、昏睡、發(fā)燒和呼吸急促、咳嗽，兩側鼻孔排出膿液，致死率極高[9]。與此同時，馬駒的種群密度、農(nóng)場棲息地的管理和環(huán)境因素(如溫度、濕度和土壤pH)對于該病原菌的傳播具有很大的影響，大多數(shù)馬紅球菌感染病例是在干燥溫暖的夏季診斷的，此時不僅具備細菌繁殖的最佳條件，而且還會使馬駒容易吸入被污染的粉塵顆粒，從而增加被感染的風險[16]。在我國，內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟大草原和呼倫貝爾大草原土壤中馬紅球菌的分離率為25.9%～30.0%, 通遼近郊則高達82.3%[17]。在廣東省部分馬場中，馬匹馬紅球菌病抗體檢出陽性率及土壤中馬紅球菌的平均菌量均高于世界其他國家及地區(qū)。而蒙古國烏蘭巴托的馬群中則未分離到馬紅球菌，造成這一差異主要是因為內(nèi)蒙古自治區(qū)的牧民不再使用傳統(tǒng)的流動式放牧，而是通過圈養(yǎng)的方式發(fā)展畜牧業(yè)。此外，統(tǒng)計學分析顯示馬紅球菌在土壤中的分布與馬匹活動有關，與季節(jié)、地理位置等其他因素無明顯相關性[18-20]。人感染馬紅球菌的案例在我國的云南、廣西、廣東、湖南等地區(qū)均有報道，感染者多為免疫缺陷患者[21-24]。

2 馬紅球菌與固有免疫

馬紅球菌感染后，宿主通過固有免疫細胞對馬紅球菌進行免疫應答，同時為激活獲得性免疫應答提供準備[16]。此部分主要討論了巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞對馬紅球菌的抗感染作用。

2.1 馬紅球菌與巨噬細胞的相互作用

巨噬細胞(Macrophages，M?)是抵抗胞內(nèi)菌感染的第一道防線，是固有免疫和適應性免疫不可或缺的重要細胞。其發(fā)揮的免疫功能有吞噬和清除病原體、對抗原進行加工和提呈、釋放多種細胞因子等[26]。馬紅球菌因其兼性胞內(nèi)寄生菌的特性，可在巨噬細胞中存活并增殖。

病原菌入侵宿主后，巨噬細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)不僅是適應性免疫應答的開始，也是調節(jié)先天性免疫應答的關鍵。由于膜識別受體不同，馬紅球菌入侵后在宿主內(nèi)的感染機制也不同[11，27-28]。Toll樣受體作為激活宿主天然免疫重要的PRRs，在對病原菌的免疫清除中起著關鍵作用[29-30]。馬紅球菌感染之后，宿主巨噬細胞會經(jīng)歷NF-κB的移位，并通過Toll樣受體2(TLR2)激活多種促炎介質產(chǎn)生，例如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-12(IL-12)以及一氧化氮(NO)[31-32]。馬紅球菌進入巨噬細胞還需要補體受體和甘露糖受體，其中補體受體主要由白細胞補體受體3型(CR3)和MHC-Ⅰ所介導。該病原菌可以直接利用其細胞膜表面的馬紅球菌-阿拉伯糖甘露聚糖(ReqLAM)與巨噬細胞的甘露糖受體結合而進入巨噬細胞，重組甘露糖結合蛋白可通過凝集素途徑激活補體系統(tǒng)，使C3b在重組甘露糖上沉積，從而促進馬紅球菌通過MHC-Ⅰ介導的途徑進入巨噬細胞[33]。

巨噬細胞吞噬病原菌之后，還可以與溶酶體融合，利用溶酶體的酸性環(huán)境將病原菌清除。馬紅球菌被巨噬細胞吞噬后可形成包含馬紅球菌的吞噬泡(R.equi-containing vacuole，RCV)，其通過破壞巨噬細胞的吞噬機制，可以在巨噬細胞中進行復制[39-40]。在此過程中，馬紅球菌毒力質粒中，vapA編碼的毒力相關蛋白A(Virulence associated protein A，VapA)起著至關重要的作用，VapA敲除的馬紅球菌突變株會喪失在巨噬細胞中復制的能力[41]。2019年Von Bargenk等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，馬紅球菌被巨噬細胞吞噬后，VapA可以轉移到吞噬體膜上，抑制質子泵ATP酶(Proton-pumping vacuolar ATPase，vATPase)的功能，另外VapA也可以轉移到溶酶體膜上，破壞膜通透性和質子梯度，引起晚期溶酶體功能紊亂，抑制吞噬體/自噬體與溶酶體融合，形成pH呈中性的環(huán)境，從而促進馬紅球菌在細胞內(nèi)的生長。

2.2 馬紅球菌與樹突狀細胞的相互作用

樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC)作為機體聯(lián)系固有免疫和適應性免疫的重要橋梁，其抗原提呈能力強，并且可以調控T淋巴細胞的分化及免疫應答，因此在機體清除病原菌感染中起著重要作用[43-44]。但是，某些病原菌也會進化出逃逸宿主樹突狀細胞免疫清除的機制，例如沙門氏菌不僅可以抑制樹突狀細胞所介導的抗原提呈逃避宿主的免疫清除[45]，還可以通過上調樹突狀細胞SIRT2的表達，導致NF-κB p65移位到細胞核，上調NOS2的基因轉錄和NO的產(chǎn)生，NO最終通過抑制T細胞的增殖從而幫助沙門氏菌逃逸宿主的免疫清除[46]。除巨噬細胞外，樹突狀細胞也參與了宿主早期對馬紅球菌感染的抵抗。類似于結合分枝桿菌與樹突狀細胞的相互作用，馬紅球菌在感染宿主之后，樹突狀細胞會誘導T淋巴細胞分化為細胞毒性T細胞對病原菌進行清除，同時也會激活巨噬細胞的殺菌功能[47]。

樹突狀細胞可以通過MHC-II類分子、CD86等提供的共刺激信號進行抗原提呈，還可以誘導T細胞的分化，但未成熟的樹突狀細胞誘導T細胞分化的能力較差[43]。小鼠的樹突狀細胞在其1周齡時，由于缺少CD80、CD86和CD11c的表達，遞呈抗原的能力較低[48]。馬駒樹突狀細胞的MHC-II的表達量較低，可能是導致宿主樹突狀細胞的抗原呈遞能力下降的原因[47]。Mérant等[49]發(fā)現(xiàn)，與成年馬相比，2～3周齡馬駒的樹突狀細胞表面分子CD14+、CD1w2+、CD86+的表達量下降，隨著馬駒生長至3個月時，CD14+、CD1w2+、CD86+的表達量增加，這表明2～3周齡馬駒的樹突狀細胞的免疫能力可能存在缺陷；細胞因子檢測的結果表明，IL-1、IL-12、IL15和IL-18的mRNA表達在成年馬與馬駒中沒有差異。綜上，馬駒容易成為馬紅球菌的易感宿主可能是因為其樹突狀細胞功能存在年齡依賴性缺陷。

2.3 馬紅球菌與中性粒細胞的相互作用

中性粒細胞(Neutrophils)作為先天性免疫抵御病原菌入侵的重要防線，其通過脫顆粒作用、活性氧(ROS)的產(chǎn)生、吞噬功能以及中性粒細胞胞外陷阱的形成抵抗病原菌的感染，此外還可以產(chǎn)生各種細胞因子和趨化因子，通過募集和激活免疫系統(tǒng)的其他效應細胞為先天免疫和適應性免疫之間提供至關重要的聯(lián)系[50]。Nerren等[51]在體外用馬紅球菌的強毒株和無毒株刺激成年馬的中性粒細胞，通過對成年馬中性粒細胞的細胞因子表達譜進行評價，與未處理組相比，成年馬中性粒細胞中TNF-α、IL-12p40、IL-6、IL-8和IL-23p19的mRNA的表達顯著上調，而IFN-γ和IL-12p35則下調；與無毒株相比，強毒株可以誘導更高的IL-23p19的mRNA表達。馬紅球菌感染后，中性粒細胞細胞因子表達譜的變化說明了中性粒細胞的細胞因子可能也會影響宿主對馬紅球菌的清除。

馬駒的中性粒細胞功能存在免疫缺陷，主要表現(xiàn)在殺菌能力和血清調理能力的降低[52-53]；同時，馬駒的中性粒細胞中細胞因子的表達呈年齡依賴性變化，這也反映了馬駒中性粒細胞的殺菌能力和血清調理能力的下降[54]。胞嘧啶-磷酸-鳥苷寡脫氧核苷酸(Cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotides，CpG-ODNs)作為一種免疫刺激DNA，在體外實驗中可以激活馬駒中性粒細胞的細胞因子表達和活性氧(ROS)的產(chǎn)生[55]。此外，Bordin等[56]發(fā)現(xiàn)TLR9的激動劑CpG2142也可以促進馬駒中性粒細胞的脫顆粒并且誘導IL-6和IL-17mRNA的表達，從而增強中性粒細胞的免疫功能。因此，雖然馬駒的中性粒細胞功能缺陷，但通過免疫刺激劑可以提高中性粒細胞的免疫功能，這可能有助于馬駒抵御馬紅球菌的感染。

3 馬紅球菌與適應性免疫

適應性免疫是指機體免疫系統(tǒng)在抗原的刺激下，產(chǎn)生一系列的免疫反應，包括抗原的識別、加工與遞呈、T、B淋巴細胞的活化、細胞因子、抗體及效應T細胞的產(chǎn)生，以及抗原被清除等過程[57]。馬紅球菌侵入后，T淋巴細胞所介導的細胞免疫應答和B淋巴細胞所介導的體液免疫應答在宿主抗感染過程中發(fā)揮著重要作用[58]。

3.1 馬紅球菌與T淋巴細胞的相互作用

T淋巴細胞是適應性免疫的重要組成部分，其識別MHC-抗原復合物后被活化、增殖、分化為效應T 淋巴細胞(主要是CD4+T 和CD8+T)，并殺傷靶細胞[59]。目前在小鼠和成年馬中證明了CD4+T細胞和CD8+T細胞產(chǎn)生的IFN-γ可以將馬紅球菌清除；同時，將成年馬特異性免疫的CD4+T細胞過繼轉移到T淋巴細胞免疫缺陷的小鼠中，可以保護小鼠免遭馬紅球菌的侵襲[60-62]。除直接殺傷靶細胞之外，不同Th細胞亞群產(chǎn)生的細胞因子在適應性免疫反應中也起著重要作用。在成年馬中，以IFN-γ產(chǎn)生為特征的Th1反應可以將馬紅球菌完全清除；同時，活化的巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生的IL-12也會刺激Th0細胞分化為Th1細胞，從而對馬紅球菌進行清除[63]。在馬駒細胞免疫的過程中，低劑量的馬紅球菌強毒株會使馬駒對馬紅球菌產(chǎn)生較強的Th1免疫反應，然而最后所有馬駒都發(fā)展為肺部病變。盡管出現(xiàn)了明顯的Th1反應，但其機體免疫的詳細機制仍需探索[64]。Wagber等[65]用佛波脂12-肉豆蔻13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate)刺激成年馬和馬駒的外周血單個核細胞，通過流式細胞術對細胞因子進行檢測的結果顯示，馬駒CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的量與成年馬相似，但IL-4的表達量較低，表明馬駒的免疫應答偏向于Th1型，Th2型細胞反應受損。成年馬體液免疫主要依賴于Th2型細胞反應的B細胞活化，但是馬駒中Th2型反應受損可能會導致馬駒的體液免疫受損[66]。

3.2 馬紅球菌與B淋巴細胞的相互作用

B淋巴細胞作為宿主體液免疫中重要的效應細胞，可以通過B細胞抗原受體(B-Cell Receptor，BCR)識別抗原、活化、增殖并分化為漿細胞，利用分泌的特異性抗體(免疫球蛋白)對病原菌進行有效清除。馬免疫球蛋白包含IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。IgG占總血清Ig的80%，是介導體液免疫的主要抗體，其含量高、分布廣，具有較強的抗感染、中和毒素和免疫調理作用。IgGa和IgGb作為成年馬血清和初乳中最豐富的IgG亞類，對于機體免疫均很重要，因為這兩個亞類均介導補體系統(tǒng)和抗體依賴性細胞毒性的激活[67-68]。然而馬駒在12周齡到8個月之間，IgGb的內(nèi)源性合成延遲，其水平顯著低于IgGa，這可能是馬駒體液免疫不能有效消除馬紅球菌的原因之一[69]。IgE在初乳攝取后不久便可以在馬駒血清和白細胞中檢測到，但生長至2～3個月時，隨著母體IgE的攝入與馬駒內(nèi)源性合成的下降，不能檢測到IgE或IgE陽性細胞[70]。黏膜IgA作為呼吸道的一道防御，馬駒剛出生的28 d內(nèi)，其鼻黏膜表面不存在IgA也可能會導致馬駒對馬紅球菌易感[69]，可以通過增強黏膜IgA保護馬駒免受氣管及支氣管中馬紅球菌的感染。

在抗體介導的體液免疫中，使用高免疫血漿或注射VapA的多肽疫苗增加宿主對馬紅球菌的免疫能力[71]。Cywes-Bentley等[72]利用馬紅球菌表面的多聚糖與N-乙酰氨基葡萄糖(Poly-N-acetyl glucosamine，PNAG)的結合疫苗，在分娩前6周和3周接種懷孕母馬，使馬駒通過初乳攝取母源抗體。結果顯示，接種疫苗母馬所生的12匹馬駒中有11匹沒有表現(xiàn)馬紅球菌肺炎的臨床特征，而未接種疫苗的對照組所生的7匹馬駒中，有6匹最終發(fā)展為馬紅球菌肺炎；此外，直接注射PNAG-高免疫血漿的馬駒可100%保護其免受馬紅球菌的侵襲，并在馬駒外周血單個核細胞中檢測到更高水平的IFN-γ。這些實驗表明，雖然B細胞介導的體液免疫存在一定的功能缺陷，但也可以降低馬紅球菌對馬駒的傷害程度。

4 展 望

宿主感染馬紅球菌的免疫機制中，馬駒因其免疫細胞功能缺陷成為易感宿主，主要表現(xiàn)為樹突狀細胞的表面分子MHC-II、CD14+、CD1w2+及CD86+的表達量較低，導致樹突狀細胞的抗原呈遞能力下降；中性粒細胞殺菌能力和血清調理能力較低；細胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-1α、IL-4、和IL-12的表達量低于成年馬等。但目前對馬駒的免疫系統(tǒng)、細胞因子及抗原提呈細胞在抗感染中所起的作用并不完全了解，例如：樹突狀細胞對T淋巴細胞分化增殖的影響和機制以及中性粒細胞是怎樣在先天免疫和適應性免疫之間發(fā)揮作用都無具體報道。因此，更加深入了解馬駒的免疫系統(tǒng)、細胞因子及抗原提呈細胞對于馬紅球菌致病機制及疫苗的研發(fā)會有很大幫助。在馬紅球菌與巨噬細胞相互作用中，其通過抑制吞噬體/自噬體與溶酶體融合，形成pH呈中性的環(huán)境，從而促進馬紅球菌在巨噬細胞內(nèi)的生長。自噬作為真核細胞中保守的降解途徑,其通過自噬前體的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合以及自噬溶酶體的降解這四個步驟對侵入性病原體進行降解，在細胞的生存、抗感染免疫等方面起著重要作用。因此，探索馬紅球菌與巨噬細胞自噬的關系有助于進一步了解該病原菌的致病機制。在馬駒的免疫的過程中，出現(xiàn)了較強的Th1型免疫反應，但最后馬駒均發(fā)展為肺部病變，這可能是因為馬駒的Th2型反應受損以及其IgGb、IgE和IgA水平較低。從馬紅球菌誘導宿主的免疫應答特點可以看出，理想的疫苗不僅要平衡Th1/Th2 免疫應答，還要誘導宿主產(chǎn)生高親和力的抗體，因此合適的抗原蛋白以及平衡Th1/Th2 免疫應答的免疫佐劑的選擇至關重要。綜上，繼續(xù)對宿主感染馬紅球菌的免疫機制進行探索對于疫苗的開發(fā)利用和病原菌的防治都有著重要意義。