2013年至2018年遼寧省柯薩奇病毒A10型分離株VP1區(qū)基因特征分析

張 倩， 于 偉， 周曉彤， 雷 露， 毛玲玲， 姚文清*

(1.遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110005；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，遼寧 大連 116011)

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是一種全球性的兒童常見急性傳染病，由多種腸道病毒引起，多好發(fā)于5歲以下兒童。腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV-A71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CV-A16)是引起手足口病最主要的兩個腸道病毒病原體。近些年來，由非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒引起的手足口病病例逐漸增加[1]，尤其是柯薩奇病毒A10型(Coxsackievirus A10，CV-A10)發(fā)病率越來越高[2-5]，CV-A10病毒引起的手足口病暴發(fā)事件在芬蘭和法國等地不斷被報道[6-13]，在我國也有多個省市報道了由CV-A10引起的手足口病病例[4、9-10、14-16]，由其他腸道病毒引起的手足口病受到越來越多的關(guān)注。2013年至2018年遼寧省手足口病病例病原學(xué)檢測結(jié)果顯示，非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒是遼寧省2013年至2018年的優(yōu)勢病原。本研究對遼寧省2013年至2018年分離到的CV-A10病毒進(jìn)行VP1區(qū)基因特征分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集與處理 采集2013年至2018年遼寧省14個市送檢的手足口病患者臨床病例陽性標(biāo)本18 013份，分別為咽拭子和糞便標(biāo)本，其中非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒臨床標(biāo)本9 431份，標(biāo)本處理方法參照國家脊髓灰質(zhì)炎和國家麻疹實驗室發(fā)布的《手足口病實驗室手冊》(2010版)。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 將處理過的標(biāo)本接種至密度為80%以上、形態(tài)良好的RD細(xì)胞上，35 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，出現(xiàn)腸道病毒特異性細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，且CPE≥75%時，判定為病毒分離陽性，收集并于-70 ℃保存，如連續(xù)兩代均不出現(xiàn)CPE則判為陰性。RD細(xì)胞為國家疾病預(yù)防控制中心脊髓灰質(zhì)炎實驗室提供。

1.2.2 病毒的鑒定 使用德國QIAGEN GmBh?EZ1 Virus Mini Kit v 2.0提取試劑盒，從病毒培養(yǎng)物中提取病毒核酸，操作步驟參照試劑盒說明書，采用實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行核酸檢測，對鑒定為CV-A10病毒的培養(yǎng)物進(jìn)行VP1區(qū)序列擴(kuò)增和測定。

1.2.3 VP1區(qū)序列擴(kuò)增 使用德國QIAGEN GmBh?One Step RT-PCR Kit 試劑盒進(jìn)行VP1區(qū)基因擴(kuò)增。 通過腸道病毒A組引物對486(5′-TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNCC-3′)、488(5′-GT-IGGRTAICCITCITARAACCAYTG-3′)和040(5′-ATGTAYRTICCIMCIGGIGC-3′)、011(5′-GCICCIG-AYTGITGICCRAA-3′)進(jìn)行腸道病毒VP1區(qū)基因RT-PCR擴(kuò)增[17]，反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件：48 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，48 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，50個循壞;72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，電泳陽性的PCR產(chǎn)物送至Invitrogen(上海)公司進(jìn)行核苷酸序列測定，測定后返還拼接序列。

1.2.4 序列分析 拼接序列進(jìn)行BLAST同源性檢索，按照腸道病毒相同基因型核苷酸序列同源性>75%的原則進(jìn)行腸道病毒型別鑒定。獲得的CV-A10病毒的VP1區(qū)基因序列與GenBank中的CV-A10代表株的基因序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析。應(yīng)用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析和氨基酸變異位點分析，Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制采用鄰接法(Neighbor-joining)，建樹的可靠性依據(jù)1000bootstrap評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 HFMD病原構(gòu)成

2013年至2018年在遼寧省內(nèi)共采集臨床手足口病病例陽性標(biāo)本9 431份，其中EV-A71、CV-A16及非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒分別為3 414、5 173、9 431份，所占比例分別為18.95%、28.71%和52.34%，非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒比例大幅增加，超過50%，取代EV-A71和CV-A16成為遼寧省手足口病的優(yōu)勢病原。

2.2 其他腸道病毒的分離和鑒定

使用RD細(xì)胞從3 669份標(biāo)本中共分離到非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒386株，對其VP1區(qū)基因測序和BLAST分析，共鑒定出12個基因型，其中CV-A10陽性165例(42.75%)，CV-A6陽性121例(31.35%)，CV-A4陽性40例(10.36%)，CV-A2陽性17例(4.40%)，CV-A5陽性3例(0.78%)，CV-A9陽性3例(0.78%)，CV-A8陽性2例(0.52%)，CV-A14陽性1例(0.26%),CV-B3陽性9例(2.33%)，CV-B2陽性6例(1.55%),CV-B5陽性1例(0.26%)，ECHO陽性2例(0.52%)，未分型腸道病毒16例(4.14%)。

2.3 CV-A10遼寧株VP1區(qū)同源性分析

從分離到的65株CV-A10毒株中按照不同年份隨機(jī)抽取47株毒株進(jìn)行VP1區(qū)基因序列擴(kuò)增。本研究獲得的47株CV-A10遼寧株VP1區(qū)基因序列核苷酸同源性為91.3%～100%，氨基酸同源性為93.9%～100%。遼寧省CV-A10分離株與GenBank中檢索的我國及其他國家的CV-A10流行株序列進(jìn)行VP1區(qū)同源性比較，與A型原型株(Kowalik)核苷酸同源性為72.4%～74.4%、氨基酸同源性為80.3%～84.8%，與B型代表株的核苷酸同源性為76.9%～81.9%、氨基酸同源性為86.4%～90.9%，與C型代表株的核苷酸同源性為92%～100%、氨基酸同源性為93.9%～100%，與D型代表株的核苷酸同源性為73.9%～76.9%、氨基酸同源性為83.3%～87.9%，47株遼寧分離株與C型代表株的同源性最高，屬于CV-A10病毒C基因型。

2.4 CV-A10遼寧株親緣進(jìn)化分析

選取國內(nèi)外CV-A10流行株與遼寧省2013年至2018年的47個分離株(2013年4株、2014年10株、2015年3株、2016年10株、2017年10株、2018年10株)的VP1片段進(jìn)化分析比對，系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1，結(jié)果表明，CV-A10 分離株的VP1序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹上分A～D 四個基因型，其中C基因型又分為C1和C2兩個亞支。1950年在美國分離的CV-A10原型株Kowalik獨(dú)立構(gòu)成A基因型，B基因型由山東省2004年和2008年分離株組成，D基因型由2008年西班牙分離株和2010年法國分離株組成，C基因型由2008年開始流行的國內(nèi)分離株組成，包括2015年江蘇分離株、2012年和2015年河北分離株、2016年寧夏分離株、2016年北京分離株、2017年和2018年云南分離株等，并形成C1、C2亞支。遼寧省流行的CV-A10分離株與A型原型株Kowalik和B、D型代表株遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，和中國地區(qū)2008年之后流行的C基因型代表株遺傳距離近、親緣關(guān)系近并且在同一進(jìn)化分支，說明CV-A10遼寧株屬于C型CV-A10病毒。其中8株遼寧分離株與C基因型代表株中的2017年、2018年云南株(LC412984、LC481434)、2017年廣西株(MK836091)、2016年北京株(MF596059)、2016年遼寧株(MG838837)遺傳距離近、親緣關(guān)系近，同處在C1進(jìn)化分支。其余39株遼寧分離株集中在C2進(jìn)化分支，與2015年江蘇株(MG838818)、2016年江西株(MG838830)、2015年廈門株(KX768167)、2012年河北株(KF246663)等遺傳距離近、親緣關(guān)系近，C2進(jìn)化分支中CV-A10遼寧分離株可以分為3個相對獨(dú)立的小的進(jìn)化分支，2014年1株與2012年河北株(KF246663)單獨(dú)處于1小分支；2013年4株和2014年1株與2008年、2009年山東株(GQ214173、GU947787)處于2小分支；另外33株(2014年7株、2015年3株、2016年4株、2017年10株、2018年9株)遼寧分離株與2014年至2018年國內(nèi)其他地區(qū)流行株處于3小分支。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，47株遼寧分離株形成C1和C2兩條不同的進(jìn)化分支，C2分支又分為3條相對獨(dú)立的小分支，表明遼寧地區(qū)CV-A10病毒的流行沒有明顯地集中在某個分支，而是由多條進(jìn)化分支共循環(huán)，C2進(jìn)化分支是優(yōu)勢流行株。

圖1 47株遼寧分離株CV-A10與其他分離株VP1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 47 CV-A10 strains in Liaoning and other strains VP1gene

2.5 CV-A10病毒VP1編碼區(qū)氨基酸變異位點分析

對VP1編碼區(qū)翻譯成氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，2013年至2018年遼寧省47株CV-A10分離株氨基酸序列在第16、21、22、23、24、25、26、27、28、31、33、43、59、70、78、79、80位點發(fā)生變異(見圖2、表1)。

圖2 CV-A10 VP1編碼區(qū)氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of CV-A10 VP1 coding region

表1 遼寧CV-A10分離株與已知基因型代表株VP1區(qū)氨基酸變異分析

續(xù)表1

3 討 論

手足口病的病原種類復(fù)雜繁多，EV-A71和CV-A16是引起我國手足口病流行和暴發(fā)的主要病原體[11-12]。長期以來對手足口病的監(jiān)測主要集中在EV-A71和CV-A16，對于非EV-A71和非CV-A16其他腸道病毒的流行病學(xué)調(diào)查和地理分布相對缺乏，CV-A10毒株的序列分析研究相對較少。但是近年來腸道病毒的其他類型，尤其是CV-A6和CV-A10等病毒逐漸演變?yōu)槭肿憧诓〉膬?yōu)勢病原[2-5，18-20]。雖然國內(nèi)的CV-A10病毒還未引起暴發(fā)感染，但有研究報告表明[3]，CV-A10是除了EV-A71外能夠單獨(dú)引起HFMD重癥病例的病毒。新加坡學(xué)者Ang等在2009年的研究報告中提出[21]，在手足口病疾控防控工作中CV-A10與CV-A16和EV-A71同等重要。2013年至2018年遼寧省的監(jiān)測結(jié)果表明，遼寧省手足口病的病原構(gòu)成發(fā)生了很大的變化，其中非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒占比最大，超過了50%；而在2008年至2012年的5年中，非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒僅占21%[22]，說明近6年非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒的構(gòu)成比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2013年的前5年的水平，其在病原譜的比重增加，取代了EV-A71和CV-A16成為優(yōu)勢病原,這表明CV-A10在其他腸道病毒中所占的比例較高，在手足口病的流行中起著不可忽視的重要作用。

VP1區(qū)核苷酸序列進(jìn)行基因分型具有與病毒血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性，是腸道病毒基因分型和遺傳進(jìn)化分析的重要基因，常作為進(jìn)化分析的標(biāo)準(zhǔn)[23]。本研究通過GenBank核苷酸數(shù)據(jù)獲取國內(nèi)外CV-A10分離株VP1區(qū)基因序列，根據(jù)VP1區(qū)核苷酸基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和同源性分析顯示，CV-A10分離株被劃分為4個基因型，分別是A、B、C、D型，這與之前Tian等[24]文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，2013年至2018年47株遼寧分離株與CV-A10病毒原型株Kowalik、D基因型的國外代表株及B基因型的國內(nèi)地區(qū)2008年之前的代表株遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系遠(yuǎn)，與C基因型代表株處于同一進(jìn)化分支，遺傳距離近，親緣關(guān)系近，屬于C基因型，2009年之后我國流行的CV-A10分離株為C基因型，這與2009年后我國其他地區(qū)流行的CV-A10病毒分離株基因型別一致[4-5,14,16,18]，由此可見，2013年至2018年遼寧分離株在進(jìn)化上并不是獨(dú)立流行的，而是和國內(nèi)其他地區(qū)同進(jìn)化共循環(huán)的。47株遼寧分離株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成2個進(jìn)化分支，C1進(jìn)化分支中5株2016年分離株和2016年遼寧株(MG838837)親緣關(guān)系最近，提示它們可能來源為同一流行株，另外3株(2014年1株、2016年1株、2018年1株)和2016年之后的國內(nèi)其他地區(qū)(云南、廣西、北京)的代表株遺傳距離較近，親緣關(guān)系近，說明具有一定傳播力，但是和C2進(jìn)化分支的遼寧分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能這些分離株發(fā)生了較多的基因序列變異重組，并未引起較大流行趨勢。C2進(jìn)化分支由3個相對獨(dú)立的小分支構(gòu)成，1分支僅包含1株LN14-68，與C2分支中的其他遼寧分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能該分離株為輸入性毒株或者不適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境氣候而沒有發(fā)生傳播。2分支包含4株2013年分離株和1株2014年分離株，與2008年、2009 年山東株親緣關(guān)系近，處在同一個分支，可能早期的遼寧CV-A10病毒是由山東傳播來的，流行一段時間后病毒毒力消失，未能繼續(xù)在遼寧傳播。3分支則是遼寧CV-A10分離株的主要流行分支，分離株數(shù)量多，流行時間長，傳播地區(qū)廣，提示這些分離株可能適應(yīng)了本地的氣候和環(huán)境，尤其是2017年和2018年分離株親緣關(guān)系更近，發(fā)展成為CV-A10病毒優(yōu)勢流行株的趨勢明顯，表明2017年和2018年的分離株在基因變異后具有較強(qiáng)的傳播力。

通過對遼寧省2013年至2018年47株分離株VP1編碼區(qū)的氨基酸分析，發(fā)現(xiàn)共有17處氨基酸發(fā)生位點變異，這與腸道病毒VP1區(qū)極易發(fā)生基因重組、基因變異快的特點有關(guān)。在第16、21、23、24、25、27、28、31、33、70、78位發(fā)生氨基酸變異，這與姚學(xué)君等[15]研究報道中國大陸地區(qū)CV-A10毒株氨基酸主要位點突變情況相一致，其中33株分離株在第23位氨基酸位點發(fā)生了A～V的突變，表明此位點是遼寧分離株氨基酸的高度變異區(qū)域。陳煒等[16]曾報道該位點是福建地區(qū)氨基酸變異的頻繁區(qū)域，提示遼寧省CV-A10病毒的變異并不是單獨(dú)存在的，而是和國內(nèi)其他地區(qū)的CV-A10病毒共同變異流行。不同年代毒株存在的變異和同一年代不同毒株存在的變異，揭示2013年至2018年遼寧省CV-A10病毒存在不同進(jìn)化過程的毒株共同流行。

引起手足口病的病原譜復(fù)雜多變，優(yōu)勢病原體也不斷交替出現(xiàn)，但遼寧省在非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒的分型鑒定及腸道病毒變異重組等方面的研究相對空白，已經(jīng)不能滿足目前遼寧省手足口病防控工作的需要，因此必須通過不斷地學(xué)習(xí)新的知識和方法，加強(qiáng)對CV-A10等非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒的病原學(xué)監(jiān)測及分子流行病學(xué)研究，以深入了解手足口病病原譜流行規(guī)律及相關(guān)腸道病毒的遺傳變異特征。