一株降解牛血液蛋白細(xì)菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究

馬咸瑩, 馬石霞, 周雪雁， 丁功濤, 孫 娜, 馬占龍, 謝雕雕, 馬忠仁

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；3.臨夏市俊林清真肉制品有限責(zé)任公司，甘肅 臨夏 731100；4.甘肅綠能農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，甘肅 天祝 733200)

動(dòng)物血液是畜禽屠宰加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，不僅產(chǎn)量高蛋白質(zhì)含量也高[1]，且富含各種必需氨基酸，脂肪含量低，素有“液態(tài)肉”之稱。據(jù)2019年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)牛、羊、豬肉產(chǎn)量為8 363萬(wàn)t，產(chǎn)生不可食廢棄物所占比例為45%，其中血液所占比例達(dá)到30%，血液中蛋白含量約為20%，這是一個(gè)巨大的動(dòng)物蛋白資源庫(kù)[2]，至今沒(méi)有得到有效處理和利用，導(dǎo)致環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。國(guó)內(nèi)外普遍采用蒸煮干燥、噴霧干燥、膨化等方法將新鮮血液簡(jiǎn)單加工后干燥成血粉，然后通過(guò)酸堿水解、微生物發(fā)酵、酶解等方法將血粉內(nèi)的蛋白質(zhì)分解為肽和氨基酸，應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)飼料中[3-4]。2001年3月1日農(nóng)業(yè)部下發(fā)《禁止在反芻動(dòng)物飼料中添加和使用動(dòng)物性飼料的通知》禁止使用動(dòng)物性飼料飼喂反芻動(dòng)物，在國(guó)內(nèi)利用血液生產(chǎn)動(dòng)物飼料沒(méi)有應(yīng)用前景。另外，蒸煮干燥、噴霧干燥、膨化、酸堿水解等方法的投資成本高，氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分易被破壞，利用率低、工藝復(fù)雜等問(wèn)題促使微生物發(fā)酵和酶解工藝的研究與發(fā)展。蛋白酶能夠有效地將蛋白質(zhì)降解為小分子肽甚至氨基酸，目前，微生物來(lái)源的蛋白質(zhì)由于其低成本、高穩(wěn)定性和特異性而被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)水解物生產(chǎn)中[5]。大多數(shù)具有重要商業(yè)價(jià)值的堿性蛋白酶都是由芽胞桿菌產(chǎn)生的，來(lái)源于芽胞桿菌的堿性蛋白酶在不同的pH和溫度范圍內(nèi)都具有很高的活性和穩(wěn)定性，具有較廣的底物特異性，并且能夠以較低的成本進(jìn)行純化[6]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于普羅威登斯菌屬細(xì)菌生產(chǎn)蛋白酶的報(bào)道極少，作為動(dòng)物腸道的正常菌群，一般在肉類(lèi)食品中容易檢測(cè)到，對(duì)蛋白質(zhì)具有分解作用[7-8]。在工業(yè)發(fā)酵方面，微生物血液發(fā)酵是通過(guò)微生物在有氧或無(wú)氧條件下的生命活動(dòng)使微生物自身產(chǎn)生能夠分解血液蛋白的酶類(lèi)，從而分解血液蛋白產(chǎn)生多肽和氨基酸，結(jié)合酶解工藝生產(chǎn)含氨基酸水溶肥的方法是解決環(huán)境問(wèn)題的友好途徑，氨基酸種類(lèi)保留也比較全面，且此途徑對(duì)原料的要求較低，植物可吸收的左旋氨基酸得到保護(hù)，寡肽含量較高，有害物質(zhì)少[9]，利用微生物對(duì)血液進(jìn)行降解既有效緩解了環(huán)境污染問(wèn)題，又有效利用了血液資源，具有較好的現(xiàn)實(shí)意義。相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，在極有限的報(bào)道中Raúl等[10]在2010年利用堿性蛋白酶水解血粉，研究顯示，該堿性蛋白酶在pH 6.24，溫度54.2 ℃和酶-底物比10%的情況下獲得最大的水解度為28.89%，其產(chǎn)物用于有機(jī)肥料的合成。本研究以甘南藏族自治州美仁草原禿鷲糞便為分離基質(zhì)，以血瓊脂培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，分離篩選牦牛血液蛋白降解菌，初步探索利用微生物降解血液蛋白生產(chǎn)有機(jī)水溶肥的可行性，為解決環(huán)境問(wèn)題和屠宰場(chǎng)血液資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離基質(zhì) 禿鷲糞便采自甘肅省甘南藏族自治州美仁草原(N 34°58′14″，E 103°5′19″，海拔3 181 m)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，血清5%，pH 7.0；②普通培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖2.5,胰蛋白胨20,NaCl 5，K2HPO42.5，pH 7.0；③初篩培養(yǎng)基(酪蛋白培養(yǎng)基(g/L))：KH2PO40.36，MgSO40.5，ZnCl20.014，NaCl 0.6，Na2HPO4·7H2O 1.07，CaCl20.002，F(xiàn)eSO40.002，酪蛋白4，胰蛋白胨0.05，瓊脂15，pH 7.0；④復(fù)篩培養(yǎng)基：哥倫比亞血平板；⑤發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，K2HPO40.4，NaCl 0.5，KH2PO40.6，MgSO40.1，F(xiàn)eSO40.02,無(wú)菌牦牛血液5%，血清5%，pH 8；⑥血液發(fā)酵培養(yǎng)基：無(wú)菌牦牛血液95%，pH 8。

1.1.3 試劑 細(xì)菌DNA提取試劑盒(TaKaRa)，5 000 bp Ladder DNA Marker(Thermo)，通用引物(北京六合華大基因科技股份有限公司)，生化試劑盒(杭州微生物試劑有限公司)，哥倫比亞血平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，培養(yǎng)基試劑均為分析純(索萊寶生物科技有限公司)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS,上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9146A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，MOST蒸汽滅菌器(MOST-T，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)，電子天平(AR224CN，奧豪斯儀器常州有限公司)，高速離心機(jī)(Pico17，熱電發(fā)光二級(jí)管有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(846-X-070-280,德國(guó)Biometra公司)，蛋白印跡免染檢測(cè)分析系統(tǒng)(No.ChemiDoc，時(shí)代聯(lián)想生物科技有限公司)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(GENESYS 10S,美國(guó)thermo)，低溫恒溫槽(DC-0510,上海啟步生物科技有限公司)，電泳儀(DYY-6D型,北京市六一儀器廠)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1CU,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，恒溫磁力攪拌器(IT-09A5,上海一恒科學(xué)儀器)，便攜式pH計(jì)(SG2-FK,梅特勒)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 禿鷲糞便樣品經(jīng)過(guò)菌種富集培養(yǎng)后，采用平板稀釋法在酪蛋白平板上進(jìn)行菌株分離培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)、菌株形態(tài)及蛋白水解圈進(jìn)行菌種初篩。將10 g樣品置于100 mL無(wú)菌水中，30 ℃震蕩30 min，取原液加入到富集培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d。將最后的富集液梯度稀釋，取0.1 mL稀釋的懸液涂布在初篩培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落，挑取具有透明圈的菌落，在另一個(gè)平板上劃線純化，多次劃線并結(jié)合顯微鏡鏡檢結(jié)果檢查菌落是否單一，直至獲得純培養(yǎng)物后甘油保存。將篩選到的菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生透明圈，選擇能夠產(chǎn)生較大透明圈菌落的菌株并將菌種擴(kuò)繁后，按5%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h，通過(guò)測(cè)定其產(chǎn)生的蛋白酶活性的高低，篩選出目標(biāo)菌株。

1.2.2 菌株鑒定 根據(jù)目標(biāo)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征及生理生化特性進(jìn)行菌株鑒定，將復(fù)篩得到的菌株在普通培養(yǎng)基平板上劃線，得到單菌落，觀察并記錄菌落形狀、大小、顏色、邊緣、透明度、表面、隆起形狀等。挑選單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)鑒定。用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株20 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按生化管中說(shuō)明將菌液分別接入各生化反應(yīng)管中培養(yǎng)至指定時(shí)間，取出培養(yǎng)的生化管進(jìn)行觀察，記錄判定其反應(yīng)結(jié)果，進(jìn)行菌株的生化特性鑒定。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取目標(biāo)菌株總DNA。引物為27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA(10 ng/μL)模板1 μL;dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL；10×ExTaqbuffer(含 Mg2+)3 μL; 27F(10 μmol/L)3 μL; 1492R (10 μmol/L)3 μL;ExTaqDNA聚合酶0.2 μL;補(bǔ)足ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST功能對(duì)分離菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，利用Mega7.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)條件研究 將保存的菌液接種于普通培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)20 h,并作為種子液應(yīng)用到后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。根據(jù)朗伯-比爾定律，培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度的測(cè)定須經(jīng)一定倍數(shù)稀釋，以保證其吸光度OD600≤1.0。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。①不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：分別將葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖、乳糖按1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將菌株接種到上述5種培養(yǎng)基中，pH自然，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600。②不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：用最適碳源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，分別將胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硝酸鈉、尿素按1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將菌株接種到上述5種培養(yǎng)基中，pH自然，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600。③不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：用最適碳源和氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源和氮源，將菌株接種至培養(yǎng)基中，pH自然，分別于20、25、30、35、40、45、50 ℃，150 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600。④不同pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響：用最適碳源和氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源和氮源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，將菌株接種至培養(yǎng)基中，于最適溫度，150 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600。⑤通過(guò)最適生長(zhǎng)條件確定生長(zhǎng)曲線 ；將菌株接種至最適培養(yǎng)基中，于最適溫度，150 r/min培養(yǎng)48 h，定時(shí)取樣測(cè)定OD600。

1.2.4 菌株蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)分析 將菌株按最適條件接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,每12 h取樣測(cè)定蛋白酶活性，從而確定該菌株最佳酶活性時(shí)間。①菌株粗酶液提取及其酶活性測(cè)定：將上述分離得到的菌株接種到50 mL普通培養(yǎng)基中,30 ℃，150 r/min培養(yǎng)22 h，作為種子液，再以5%(體積分?jǐn)?shù))接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h，以4 ℃，10 000 r/min離心20 min，收集上清液，作為蛋白酶測(cè)定的粗酶液。采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性(GB/T 23527-2009)。② pH對(duì)蛋白酶活性的影響：分別取1 mL粗酶液加入到不同試管中，用磷酸緩沖液稀釋到pH為5、6、7、8、9、10后與同樣pH值的1%酪蛋白溶液反應(yīng)10 min，福林酚法測(cè)定蛋白酶活性。③溫度對(duì)蛋白酶活性的影響：分別取1 mL粗酶液加入到不同試管中，用磷酸緩沖液(pH值7.2)適當(dāng)稀釋，于30、40、50、60、70 ℃下與1%的堿性酪蛋白溶液反應(yīng)10 min，用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性。④蛋白酶在不同溫度下的穩(wěn)定性：取適量粗酶液加入到不同試管中，40、50、60、70 ℃保溫2 h，以堿性酪蛋白為底物，每30 min測(cè)定蛋白酶活性，最初酶活性為100%。⑤蛋白酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性 ：取適量粗酶液加入到不同試管中，用磷酸緩沖液稀釋到pH為7、8、9、10，于40 ℃保溫2 h后，以堿性酪蛋白為底物測(cè)定蛋白酶活性。

1.2.5 血液蛋白降解效果 將目標(biāo)菌株的種子液接種到400 mL血液發(fā)酵培養(yǎng)基中(含無(wú)菌血液95%，體積分?jǐn)?shù))，菌液接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))，搖瓶培養(yǎng)4 d，以不加菌種的三角瓶培養(yǎng)基為對(duì)照。甲醛值法[11]測(cè)發(fā)酵液的氨基態(tài)氮，凱式定氮法[12]測(cè)底物所含總氮，然后根據(jù)公式計(jì)算底物降解率。

式中，DH：發(fā)酵液降解度(%)，A：發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量(mg)，N：底物中所含總氮含量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

實(shí)驗(yàn)得到10株細(xì)菌菌株能夠在酪蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，其中能夠在血瓊脂平板上產(chǎn)生透明圈的有5株，編號(hào)分別為NwMCC01910069、NwMCC01910070、NwMCC01910071、NwMCC0191-0072、NwMCC01910073，說(shuō)明這5株菌均能分解血液蛋白。以透明圈直徑與菌落直徑比值D作為血液蛋白酶高低的標(biāo)準(zhǔn)，如表1、圖1所示，菌株NwMCC01910069的D值和酶活性明顯高于其他菌株，因此作為下一步的研究菌株。

圖1 菌株NwMCC01910069透明圈Fig.1 Strain NwMCC01910069 transparent circle

表1 菌株平板初篩透明圈與菌落直徑比值

2.2 菌株鑒定

菌株NwMCC01910069菌落呈灰白色，中等大小、濕潤(rùn)凸起、邊緣整齊，顯微鏡觀察NwMCC01910069菌體為桿狀，革蘭染色陰性。對(duì)菌株NwMCC01910069進(jìn)行糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P測(cè)定試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)及吲哚試驗(yàn)等生化特性的測(cè)定，結(jié)果如表2所示。測(cè)序結(jié)果顯示該菌株的16S rRNA基因核酸序列全長(zhǎng)約1 500 bp，將此序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，與Providenciavermicola同源性為99.71% ，與Providenciarettgeri同源性為99.36%。結(jié)合其形態(tài)特征和生化特性，分離菌株NwMCC01910069屬于Providencia屬。利用Mega7.0軟件構(gòu)建以16S rRNA基因全序列為基礎(chǔ)的Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，測(cè)得的16S rRNA基因序列提交NCBI獲得GenBank登錄號(hào)MT613936，命名為Providenciasp. NwMCC01910069。

表2 菌株NwMCC01910069的主要生化特性

圖2 基于16S rRNA 基因序列建立的 NwMCC01910069 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of NwMCC01910069 strain based on 16S rRNA gene sequence

2.3 碳源、氮源、溫度、pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

菌株P(guān)rovidenciasp. NwMCC01910069以乳糖作為碳源時(shí)有較高的生長(zhǎng)量，以麥芽糖作為碳源時(shí)生長(zhǎng)情況最好，明顯高于淀粉、蔗糖、葡萄糖，表明麥芽糖是該菌株生長(zhǎng)的最佳碳源(圖3A)。酵母粉作為有機(jī)氮源對(duì)該菌株生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用，可能是由于有機(jī)氮源營(yíng)養(yǎng)比無(wú)機(jī)氮源豐富，尤其是酵母粉作為速效氮源，其中的氮源物質(zhì)主要以較易吸收的多肽和氨基酸形式存在，可通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用直接被菌體利用，使得菌體生長(zhǎng)旺盛(圖3B)。該菌體在30 ℃生長(zhǎng)情況最優(yōu)，在20～50 ℃均有較高的生長(zhǎng)量，由此可知，該菌株具有較寬的生長(zhǎng)溫度，能夠耐受50 ℃高溫(圖3C)。該菌株在中性和強(qiáng)堿環(huán)境下表現(xiàn)出較高的生長(zhǎng)量，可知菌株P(guān)rovidenciasp. NwMCC01910069不耐酸，在中性和強(qiáng)堿性條件下可大量生長(zhǎng)(圖3D)。該菌株經(jīng)過(guò)4 h的遲緩期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在此期間菌株生長(zhǎng)速度很快，24 h后生長(zhǎng)速率減緩，32 h達(dá)到最大生物量且趨于穩(wěn)定，本研究選取20～24 h的菌液作為傳代接種液(圖4)。

圖3 碳源、氮源、溫度和pH對(duì)菌株NwMCC01910069生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of carbon source, nitrogen source, temperature and pH on the growth of strain NwMCC01910069

圖4 菌株NwMCC01910069生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strain NwMCC01910069

2.4 蛋白酶酶學(xué)特性分析

2.4.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及菌株產(chǎn)酶曲線 以酪氨酸濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，按照GB/T 23527-2009所述方法繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)該圖計(jì)算得出吸光常數(shù)K為99(圖5)。菌株NwMCC01910069生長(zhǎng)12 h后上清液中可測(cè)得少量酶活性，產(chǎn)酶曲線呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，隨著菌體生物量的積累，酶活性逐漸增大，于48 h達(dá)到最大酶活性22.62 U/mL,這與菌體產(chǎn)酶特性相符，菌體產(chǎn)酶量在穩(wěn)定期快速積累，之后菌體隨著環(huán)境有毒代謝產(chǎn)物的積累而死亡，酪蛋白部分降解，使發(fā)酵液中酶活性又逐漸下降(圖6)。

圖5 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.5 Standard tyrosine curve

圖6 菌株NwMCC01910069產(chǎn)酶曲線 Fig.6 Enzyme production curve of strain NwMCC01910069

2.4.2 pH對(duì)蛋白酶活性的影響 該蛋白酶在酸性條件下幾乎沒(méi)有活性，而在pH值7～10的范圍內(nèi)具有較高的蛋白酶活性，表明該蛋白酶為堿性蛋白酶(圖7)。當(dāng)pH值為9時(shí)蛋白酶活性為22.29 U/mL，達(dá)到最大值；pH高于9時(shí)蛋白酶活性略有下降。pH為7～10的條件下處理2 h后進(jìn)行酶促反應(yīng)，以最初酶活性為100%，該酶在中性和堿性條件下都有相對(duì)較高的穩(wěn)定性，依然保留了50%以上的酶活性(圖8)。

圖7 pH對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.7 The effect of pH on protease activity

圖8 pH對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響 Fig.8 The effect of pH on protease stability

2.4.3 溫度對(duì)蛋白酶活性的影響 菌株NwM-CC01910069所產(chǎn)蛋白酶40 ℃達(dá)到最大活性，但在40 ℃以上時(shí)蛋白酶活性顯著下降，30～60 ℃范圍內(nèi)，酶活性保持在40%以上(圖9)。該酶分別在40、50、60、70 ℃保溫過(guò)程中測(cè)定其剩余酶活性。該酶在40 ℃時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，保溫2 h保持約60%以上的酶活性(圖10)。

圖9 溫度對(duì)蛋白酶活力的影響 Fig.9 The effect of temperature on protease activity

圖10 溫度對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響 Fig.10 The effect of temperature on the stability of protease

2.5 血液蛋白降解效果

將菌株P(guān)rovidenciasp. NwMCC01910069接種到血液發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵4 d，測(cè)得實(shí)驗(yàn)組中氨基態(tài)氮含量為481.92 mg/100 mL，對(duì)照組中氨基態(tài)氮含量為112.68 mg/100 mL，其中底物被降解之前血液中總氮含量為2 841.71 mg/100 mL。除去血液蛋白降解前所含氨基態(tài)氮，通過(guò)DH公式計(jì)算得出該菌株對(duì)血液蛋白的降解率為18.35%。說(shuō)明該菌株對(duì)血液有較強(qiáng)的適應(yīng)性且能夠一定程度上降解血液蛋白。

3 討 論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)能夠降解血液蛋白的菌株主要有真菌，包括黑曲霉、米曲霉、毛霉等以及蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌等[13-17]細(xì)菌，然而商業(yè)化應(yīng)用的有效菌株很少。Yao等[18]從屠宰場(chǎng)取樣分離出一種可降解血紅蛋白的短小芽胞桿菌，當(dāng)血粉添加量為2.1%時(shí)，可在36 h內(nèi)降解血紅蛋白達(dá)到85%，旨在運(yùn)用于酶解血粉作為動(dòng)物飼料補(bǔ)充的生物工藝過(guò)程；Zhang等[19]利用基因工程方法將米曲霉蛋白酶基因重組到畢赤酵母菌中降解血細(xì)胞應(yīng)用于動(dòng)物飼料，當(dāng)血液添加量為3.15%時(shí)，降解率達(dá)到49.05%。張濱[20]利用亞硝酸和紫外線誘變處理后的蠟樣芽胞桿菌亞種降解血紅蛋白應(yīng)用于動(dòng)物飼料，當(dāng)血紅蛋白添加量為1.05%時(shí)，血紅蛋白降解率為53.29%。目前對(duì)降解血液菌株的研究報(bào)道顯示，底物中血液含量不足10%時(shí)，菌株對(duì)血液具有較高的降解率，由于菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，導(dǎo)致培養(yǎng)基成分復(fù)雜，從而限制了屠宰場(chǎng)血液蛋白低成本資源化的廣泛應(yīng)用。研究表明，微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生各種蛋白酶能將大分子蛋白質(zhì)降解成小分子的多肽和氨基酸[21]。本研究從禿鷲糞便中分離的菌株普羅威登斯菌對(duì)較高溫度表現(xiàn)比較敏感，可以在20～35 ℃之間較好生長(zhǎng)，該菌株在酸性較強(qiáng)的環(huán)境中幾乎無(wú)法生長(zhǎng)，可以在中性和堿性環(huán)境中產(chǎn)生比較高的生物量。該菌株在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后達(dá)到最大酶活性22.62 U/mL，該蛋白酶在40 ℃時(shí)酶活性最高，對(duì)pH具有廣泛的耐受性，在中性和堿性條件下幾乎保持最初酶活性，屬于可耐較高溫度的堿性蛋白酶，該菌對(duì)血液蛋白有較好的降解效果，當(dāng)血液添加量為95%時(shí)，血液蛋白的降解率達(dá)到18.35%，降解率高于崔瑋琪等[22]的枯草芽胞桿菌。本研究所用的血液發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，僅含有大量的無(wú)菌血液和極少量隨種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的金屬離子，表明菌株P(guān)rovidenciasp. NwMCC01910069對(duì)高濃度血液具有較強(qiáng)的適應(yīng)性且能有效降解血液蛋白，但菌株P(guān)rovidenciasp. NwMCC01910069酶活性與已報(bào)道的高產(chǎn)酶菌株[16，20]有一定的差距，可能是因?yàn)樵摼戤a(chǎn)生的蛋白酶未及時(shí)釋放到胞外或培養(yǎng)基中，缺乏無(wú)機(jī)鹽和微量元素及碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，限制了實(shí)驗(yàn)中候選菌株快速大量繁殖及蛋白酶的產(chǎn)生。有待通過(guò)細(xì)胞破碎、優(yōu)化培養(yǎng)基組分，對(duì)候選菌株進(jìn)行基因改造及誘變育種，從而提高菌株繁殖能力和產(chǎn)酶能力，為進(jìn)一步利用該菌株降解血液蛋白生產(chǎn)有機(jī)水溶肥提供參考。