大伙房水庫細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其環(huán)境驅(qū)動因子研究

邵纓迪, 趙 文*， 尹東鵬， 王美儒， 鄒京京， 楊鳳山, 徐 鋒, 王 歡

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，遼寧 大連 116023；2.遼寧潤中供水有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽 110166；3.遼寧省大伙房漁業(yè)有限責(zé)任公司,遼寧 撫順 113003)

微生物作為水域生態(tài)系統(tǒng)極其重要的生物因子，除可作為重要的餌料資源外，還對水環(huán)境的變化具有較高的敏感性，如微生物種類、數(shù)量及產(chǎn)物均可反映水質(zhì)的好壞[1-2]，此外，還具有降解污染物、凈化水體的功能。所以微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性與水質(zhì)狀況聯(lián)系密切[3-5]，在淡水水域生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮了無可替代的作用[6]。因此，了解水體中微生物的群落分布特征具有重要意義，一方面可以用于闡明微生物群落與其生境的關(guān)系，另一方面可以對污染系統(tǒng)實施有效的生物修復(fù)措施[7]。然而在自然環(huán)境中，僅有1%的細(xì)菌類群可能通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法獲得，人類對微生物菌群的認(rèn)知仍然較少[8-9]，雖然關(guān)于水庫水體微生物群落分布特征的研究已有一些報道[10-11]，但目前對水庫微生物結(jié)構(gòu)季節(jié)性變化特征的研究報道相對較少。因此，研究微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，以及隨著不同季節(jié)的變化差異具有重要意義，可以使人們更全面地了解以及評估生態(tài)環(huán)境[12]。大伙房水庫不僅用于供水，還可以進(jìn)行灌溉、養(yǎng)魚、發(fā)電以及防洪[13-14]。截止2018年11月，大伙房水庫輸水工程已累計向7座城市和大型企業(yè)安全穩(wěn)定供水40×108m3，占部分城市市政供水量的90%以上，有力地保障了居民的生活用水和經(jīng)濟(jì)社會的可持續(xù)發(fā)展[15]。由于大伙房水庫肩負(fù)著飲用水安全以及社會發(fā)展的重任，其水質(zhì)保護(hù)顯得尤為重要。然而，由于近些年水庫上游的礦業(yè)發(fā)展及各大小工廠的興起，造成工業(yè)廢水的流入[16]，同時水庫周邊人們生活中大量使用農(nóng)藥、化肥、洗滌劑產(chǎn)生的廢液，對大伙房水庫整體流域也造成一定污染[17-18]，因此，了解水庫微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系，可為水庫生態(tài)功能研究提供參考，對促進(jìn)水庫水環(huán)境質(zhì)量的改善也將起到重要作用[11]。本研究旨在為探究大伙房水庫微生物多樣性特點(diǎn)，為大伙房水庫的生態(tài)環(huán)境提供有力的安全保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集地 水樣采自遼寧撫順大伙房水庫現(xiàn)場，位于遼河支流、渾河中上游和撫順市東郊渾河中游，匯集渾河、蘇子河、杜河水源于一處。

1.1.2 儀器與設(shè)備 水生80型采水器；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(購自河南省予華儀器有限公司)用于水樣抽濾，HQ30d型便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(購自美國Hach公司)用于現(xiàn)場測定，孔徑0.45 μm的微孔濾膜(購自上海興亞凈化材料廠)。

1.2 方法

1.2.1 采樣時間及站位設(shè)置 2015年5月至2016年4月，對大伙房水庫4個季度進(jìn)行水樣采集，根據(jù)水庫實際地形，設(shè)置6個斷面、16個采樣站位：上游渾河入河口采樣站位用字母A1、A2表示，蘇子河入河口采樣站位用字母B1、B2表示；中游采樣站位用字母C1、C2、C3表示；中下游采樣站位用字母D1、D2、D3表示；下游壩前采樣站位用字母E1、E2、E3表示，社河大溝采樣站位用字母F1、F2、F3表示。水表、中、底共采樣10次后混合，將所有樣品密封在無菌容器中，送回實驗室進(jìn)行抽濾，微孔膜過濾后放入冷凍管中并添加DNA保存溶液，-80 ℃保存。調(diào)查范圍及站位設(shè)置見圖1。

圖1 大伙房水庫采樣站位Fig.1 Sampling station in Dahuofang Reservoir

1.2.2 樣品名稱設(shè)置 采集64個樣品名稱如圖2橫坐標(biāo)所示，Ya1.1表示春季在A1站位采集的樣品；Ya1.2表示夏季在A1站位采集的樣品；Ya1.3表示秋季在A1站位采集的樣品；Ya1.4表示冬季在A1站位采集的樣品，以此類推。組別名稱如圖3橫坐標(biāo)所示，將上游入河口A1、A2、B1、B2站位歸為1組用ab表示；C1、C2、C3站位歸為1組用c表示；D1、D2、D3站位歸為1組用d表示；E1、E2、E3站位歸為1組用e表示；F1、F2、F3站位歸為1組用f表示，如Yab1、Yab2、Yab3、Yab4 分別表示上游入河口在春、夏、秋、冬4個季節(jié)樣品組別的各自名稱，以此類推。

1.2.4 基因組DNA提取及16S rDNA PCR擴(kuò)增 大伙房水庫水樣中的基因組DNA參照CTAB方法對其進(jìn)行提取。16S rDNA PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min； 98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min， 30個循環(huán)。之后凝膠回收。文庫構(gòu)建和上機(jī)測序以及測序數(shù)據(jù)處理等均由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.5 統(tǒng)計分析 使用Excel進(jìn)行水體理化指標(biāo)參數(shù)計算并分析，使用Qiime軟件(Version 1.7.0)進(jìn)行樣品的Shannon-Wiener指數(shù)計算。使用CANOCO for window4.5進(jìn)行CCA分析，并結(jié)合環(huán)境因素分析樣品間的物種組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大伙房水庫的細(xì)菌多樣性分析

64個樣品的細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)的高通量測序共得到有效序列3 547 147個序列標(biāo)簽，平均數(shù)為55 424，平均長度為253.375 bp。97%相似性水平上進(jìn)行聚類，平均聚成1 459個OTUs。對各樣本中OTU多樣性進(jìn)行分析，利用Shannon-Wiener指數(shù)表對16個樣點(diǎn)的細(xì)菌多樣性進(jìn)行比較分析，表1顯示全年大伙房水庫細(xì)菌群落Shannon-Wiener指數(shù)平均達(dá)7.312，由大到小的季節(jié)順序為秋、春、夏、冬。大伙房水庫水生細(xì)菌門水平上的物種相對豐度見圖2，各樣品相對豐度排名前10的細(xì)菌類群從高到低分別為變形菌門(Proteobacteria，36.11%)、藍(lán)菌門(Cyanobacteria，27.37%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，12.20%)、放線菌門(Actinobacteria，8.81%)、浮霉菌門(Planctomycetes，4.91%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，4.36%)、1個未分類菌群(others，3.78%)、酸桿菌亞門(Acidobacteria，1.07%)、厚壁菌門(Firmicutes，0.69%)、綠彎菌門(Chloroflexi，0.46%)和棲熱菌門(Thermi，0.24%)，變形菌門、藍(lán)菌門、擬桿菌門和放線菌門是大伙房水庫水體中4個主要微生物菌群。除在各個分類地位下不明確的菌屬外，共發(fā)現(xiàn)54門、135綱、220目、279科、412屬，其中，優(yōu)勢菌屬為Fluviicola(1.17%)、聚球藻屬(Synechococcus,1.24%)、黃桿菌屬(Flavobacterium,1.19%)、短波單胞菌屬(Brevundimonas,1.14%)。春季A1樣點(diǎn)最占優(yōu)勢的為變形菌門，占該樣品總序列數(shù)的58.59%，A2樣點(diǎn)最占優(yōu)勢的為變形菌門和藍(lán)菌門，分別占該樣本總序列數(shù)的35.04%和30.57%；B1樣點(diǎn)藍(lán)菌門占33.23%，變形菌門占31.81%；B2樣點(diǎn)藍(lán)菌門占22.32%，變形菌門占45.83%；C1樣點(diǎn)藍(lán)菌門占43.83%，變形菌門占30.06%；C2樣點(diǎn)藍(lán)菌門占13.23%，變形菌門占56.63%；C3樣點(diǎn)藍(lán)菌門占19.25%，變形菌門占47.16%；D1樣點(diǎn)藍(lán)菌門占18.38%，變形菌門占44.61%；D2樣點(diǎn)藍(lán)菌門占16.21%，變形菌門占46.25%；D3樣點(diǎn)藍(lán)菌門占10.89%，變形菌門占51.81%，擬桿菌門占15.36%；E1樣點(diǎn)藍(lán)菌門占16.17%，變形菌門占37.93%；E2樣點(diǎn)藍(lán)菌門占16.61%，變形菌門占42.74%；E3樣點(diǎn)藍(lán)菌門占17.17%，變形菌門占45.19%；F1樣點(diǎn)藍(lán)菌門占19.46%，變形菌門占42.66%；F2樣點(diǎn)藍(lán)菌門占26.51%，變形菌門占37.01%；F3樣點(diǎn)藍(lán)菌門占21.42%，變形菌門占43.19%。進(jìn)一步分析表明，在春季除了C1樣點(diǎn)中變形菌門所占比例小于藍(lán)菌門所占比例，其他樣點(diǎn)均為變形菌門所占比例大于藍(lán)菌門。夏季、秋季和冬季，藍(lán)菌門在各樣點(diǎn)的比例增加明顯，變形菌門在各樣點(diǎn)的比例減少，擬桿菌門在各樣點(diǎn)的比例增加。

表1 大伙房水庫細(xì)菌多樣性指數(shù)

圖2 大伙房水庫微生物門水平上的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of species at microbial phylum level in Dahuofang Reservoir

在屬水平上，選取排名前35的物種注釋及豐度信息，從物種及樣品組兩個方面聚類，繪制成如圖3的熱圖，并使用不同的顏色指示主要分類單元聚類的含量。發(fā)現(xiàn)4個季節(jié)這幾個采樣點(diǎn)在菌群結(jié)構(gòu)組成上存在一定的差異，結(jié)果顯示這四個季節(jié)中，春季和夏季菌群結(jié)構(gòu)組成差異不大，夏季D點(diǎn)位的細(xì)菌種類明顯增多，而秋季和冬季種群種類明顯減少，說明不同季節(jié)的大伙房水庫水體中微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。夏季聚球藻屬(Synechococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、異常球菌屬(Deinococcus)、柄桿菌屬(Caulobacter)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)聚集較多；秋季涅瓦河菌屬(Nevskia)、魯?shù)?nèi)拉菌屬(Rudanella)、芽單胞菌屬(Blastomonas)、浮霉菌屬(Planctomyces)、原綠發(fā)藻屬(Prochlorothrix)、豐佑菌屬(Opitutus)、擬柱孢藻屬(Cylindrospermopsis)、假魚腥藻屬(Pseudanabaena)、多核桿菌屬(Polynucleobacter)、古字狀菌屬(Runella)聚集較多；冬季黃桿菌屬(Flavobacterium)、流感病毒(Fluviicola)、鐵細(xì)菌屬(Crenothrix)、假單胞菌屬(Pseudomonas)聚集多；春季吞菌弧菌屬(Peredibacter)、枝動菌屬(Mycoplana)、墨氏菌屬(Rheinheimera)、紅長命菌屬(Rubrivivax)聚集多。

圖3 細(xì)菌物種豐度聚類Fig.3 Bacterial species abundance clustering

2.2 微生物群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

圖4 大伙房水庫細(xì)菌VPA結(jié)果Fig.4 VPA results of bacteria in Dahuofang Reservoir

圖5 大伙房水庫細(xì)菌菌群與水體理化因子的CCA 分析Fig.5 CCA analysis of bacterial community and physical and chemical factors

表2 水庫細(xì)菌與環(huán)境因子的CCA envfit分析

2.3 環(huán)境因子與微生物物種豐度

圖6 大伙房水庫細(xì)菌與環(huán)境因子的Spearman相關(guān)性分析Fig.6 Spearman correlation analysis of bacteria and environmental factors in Dahuofang Reservoir

2.4 大伙房水庫不同樣品差異基因分析

基于OTU水平的無度量多維標(biāo)定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling，NMDS)分析(圖7)，stress值為0.084表明結(jié)果穩(wěn)定，具參考價值，從全年結(jié)果來看，冬季所有樣本與其他3個季節(jié)所有樣本中微生物組成差異性顯著，春季的上游點(diǎn)位微生物與同季節(jié)其他點(diǎn)位微生物構(gòu)成差異大，春季(除上游點(diǎn)位)與夏季和秋季各點(diǎn)位之間的距離較近表示差異性小。LDA的進(jìn)化分支(LDA Effect Size)顯示樣品組間存在豐度差異顯著的物種，由圖8可以看出不同樣品的差異微生物菌屬，以門、綱、目、科、屬水平信息表示。春季樣品在大伙房水庫中下游的門水平上浮霉菌門(Planctomycetes)有顯著差異，在屬水平上大伙房水庫下游腐螺旋菌屬(Saprospira)存在顯著差異；夏季樣品與秋季樣品在門水平上上游點(diǎn)位浮霉菌門(Planctomycetes)有顯著差異；冬季大伙房水庫中游在門水平上放線菌門(Actinobacteria)細(xì)菌有顯著差異，放線菌門的1個綱Actinomycetales和1個目ACK_M1存在顯著差異。

圖7 大伙房水庫NMDS分析Fig.7 Analysis of NMDS in Dahuofang Reservoir

圖8 春(A)、夏(B)、秋(C)、冬(D)大伙房水庫LDA的進(jìn)化分支Fig.8 Spring(A), summer(B),autumn(C),winter (D) evolution of LDA in Dahuofang Reservoir

3討 論

多樣性指數(shù)是反映水域生態(tài)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)特征的重要指標(biāo)，大伙房水庫的菌群結(jié)構(gòu)隨季節(jié)性變化特征是通過16S rDNA擴(kuò)增子測序方法闡明的，采用Shannon-Wiener指數(shù)反映大伙房水庫水體微生物的多樣性，結(jié)果表明Shannon-Wiener指數(shù)平均達(dá)7.312，與其他水體相比，處于中間水平，且大伙房水庫水中微生物多樣性指數(shù)存在季節(jié)變化，這與張雅潔等[20]、沈烽等[21]研究結(jié)果相似。出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象可能是因為水體受不同季節(jié)溫度的影響，冬季溫度低，抑制了水中細(xì)菌的代謝，并減慢了生長速度[22]，而秋季與夏季溫度可能更適合菌群繁殖。排除溫度這一影響因素外，秋季有機(jī)質(zhì)豐富也是主要原因，趙海萍等[23]指出10月份的初級生產(chǎn)力影響渤海灣浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布，水體中的浮游植物在秋季大量生長繁殖，且這過程中產(chǎn)生的有機(jī)物可作為細(xì)菌的主要營養(yǎng)來源之一，所以，細(xì)菌能在秋季出現(xiàn)大量繁殖的現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致其多樣性增加。基于OTU的物種分類分析，序列比對結(jié)果顯示，各樣點(diǎn)間、不同季節(jié)各個樣品的菌群組成在門級上相差不大，但仍具有規(guī)律性，在門水平上，優(yōu)勢菌門為變形菌門、藍(lán)菌門和擬桿菌門，這與研究的大多數(shù)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)結(jié)果相似，如萬甜等[24]研究的渭河流域與張磊等[25]研究的巢湖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)結(jié)果相似。

本研究中豐度排名前十的菌種在不同季節(jié)豐度有所不同，藍(lán)藻門在冬季豐度最高為50%，在春夏秋季約為22%；變形菌門在春夏秋季豐度高為45%，冬季豐度為20%；擬桿菌門在冬季豐度高為18%，在秋季豐度低為8%。個別門級中的屬種在其他季節(jié)豐度較高。如Fluviicola屬于擬桿菌門在冬季的豐度高范圍在0.03～0.08，在春夏秋季豐度范圍在0.003～0.01。藍(lán)細(xì)菌聚球藻屬屬于藍(lán)菌門，在夏季和秋季豐度高(0.02～0.06)，在春季較高(0.005～0.008)，冬季最低(0.000 1～0.000 4)。黃桿菌屬屬于擬桿菌門在冬季豐度最高(0.01～0.04)，在春夏秋季豐度較低(0.004～0.03)。短波單胞菌屬屬于變形菌門，在冬季豐度最低(0.000 2～0.000 6)，在夏季豐度最高(0.01～0.06)。在大伙房水庫中這些優(yōu)勢菌屬的豐度較低，微生物種類卻非常豐富，可能在其他水域中，部分低豐度菌種在競爭中成為優(yōu)勢種，這些差異可能是由于地理形勢上或氣候條件等不同的環(huán)境因素造成的，也可能是在研究手段或數(shù)據(jù)采集量上存在差異造成的。

大伙房水庫不同樣品差異基因分析的結(jié)果表明，微生物群落結(jié)構(gòu)在同一季節(jié)各采樣點(diǎn)之間存在一定的地理差異，在不同季節(jié)時存在一定的季節(jié)差異，在冬季時最低，秋季最高，春季和夏季微生物群落結(jié)構(gòu)較為相近。

環(huán)境因子的變化影響著微生物豐度的變化，本研究揭示了大伙房水庫中，各環(huán)境因子與各微生物群落豐度的關(guān)系。同時發(fā)現(xiàn)除紅桿菌屬(Rhodobacter)與經(jīng)度和緯度呈顯著正相關(guān)外，其余各菌群與經(jīng)度、緯度無顯著性差異。這與前面分析的不同季節(jié)屬水平的豐度結(jié)果相符合，聚球藻屬(Synechococcus)等細(xì)菌富集在夏季，正是因為夏季溫度高，適宜生長。Fluviicola等與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，所以在冬季聚集。Wu等[38]指出湖泊沉水植物的分布顯著影響細(xì)菌多樣性。而無機(jī)氮與可溶解活性磷顯著影響俄亥俄河菌群分布[39]。王萃等[40]發(fā)現(xiàn)總有機(jī)碳影響土壤中氨氧化細(xì)菌的分布。綜上所述，微生物物種豐度與環(huán)境因子存在相關(guān)性，具體的相互作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。本研究運(yùn)用高通量測序法分析了大伙房水庫細(xì)菌群落組成與環(huán)境因素之間的關(guān)系，為大伙房水庫水質(zhì)管理提供參考。