基于多拷貝鱖魚β-防御素基因的重組畢赤酵母菌株構(gòu)建

呂星星， 陶 妍,2*， 謝 晶,2， 錢韻芳,2

(1．上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2．上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

β-防御素(β-defensin)是大多數(shù)生物免疫系統(tǒng)中的重要蛋白質(zhì)免疫因子，屬于陽離子型的小分子抗菌肽，最初在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，具有抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸埃希菌(Escherichiacoli)的活性[1]。魚類來源的β-防御素基因最早發(fā)現(xiàn)于斑馬魚(Daniorerio)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)和青斑河豚(Tetraodonnigroviridis)[2]中，之后從團頭魴(Megalobramaamblycephala)[3]、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[4]和大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[5]等魚種中分離到β-防御素基因。近年來，關(guān)于β-防御素的重組DNA表達研究時有報道，例如，有兩位學(xué)者分別以點帶石斑魚和斑馬魚的β-防御素基因為研究對象，實現(xiàn)了其在畢赤酵母中的重組DNA表達[6-7]；此外，團頭魴和大西洋鱈魚中的β-防御素基因也在大腸埃希菌BL21中成功表達[3，5]。然而，上述研究在構(gòu)建重組菌株時轉(zhuǎn)入的均是含單拷貝基因的常規(guī)表達載體，絕大多數(shù)重組菌株產(chǎn)β-防御素的能力有限，因而表達量并不高?；谥亟MDNA技術(shù)的外源蛋白質(zhì)表達受多種因素的影響，諸如目的基因的核苷酸序列特性(密碼子偏愛性、AT含量等)、表達載體在宿主染色體上的整合位點、目的基因拷貝數(shù)、宿主菌株的生命力、培養(yǎng)條件和甲醇利用表現(xiàn)型等，而這些因素中，以基因拷貝數(shù)尤為重要[8-10]。增加基因拷貝數(shù)的有效途徑包括目的基因的串聯(lián)和多拷貝表達盒載體的構(gòu)建，前者是將目的基因通過特定連接點或者結(jié)構(gòu)連接點，使多個相同基因組成串聯(lián)體，在同一啟動子作用下完成轉(zhuǎn)錄，最終提高目的基因的表達量，后者所指的表達盒類似一種模塊元件，其自帶目的基因、獨立的啟動子、核糖體結(jié)合位點和終止子等一整套表達調(diào)控元件，構(gòu)成的是獨立的順式作用元件，尤其是多個表達盒可以在同一載體中獨立同向連接，構(gòu)成含多表達盒的表達載體，其轉(zhuǎn)化宿主后，各個表達盒的基因可獨立轉(zhuǎn)錄翻譯為肽單體，從而實現(xiàn)多個基因的共表達[11]。Teng等[12]構(gòu)建了含8拷貝表達盒的腐生子囊菌(Pseudoplectanianigrella)防御素plectasin的表達載體，其在畢赤酵母中的表達量較單拷貝表達載體提高了1.63倍。另有學(xué)者研究了疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase，TLL)的表達量與TLL基因表達盒數(shù)目之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)重組畢赤酵母菌株GS115/9k-TLL#3(3個含TLL基因的表達盒)產(chǎn)TLL的量可達27 000 U/mL，而GS115/9k-TLL#1的表達量僅為4 350 U/mL[13]。此外，對于生長激素與人血白蛋白的復(fù)合蛋白[14]、豬胰島素前體[15]和哺乳動物水通道蛋白[9]等的類似研究亦有報道。近來，我們構(gòu)建了產(chǎn)鱖魚β-防御素(Sinipercachuatsiβ-defensin，ScBD)的重組畢赤酵母菌株X-33/pPICZαA-ScBD，該菌株含有的是一個表達盒的表達載體，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后，獲得表達量為2.53 mg/L的重組ScBD；雖然表達量很低，但它對革蘭陽性的金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)和革蘭陰性的副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)均顯示了良好的抑菌活性。據(jù)此，本研究旨在上述研究的基礎(chǔ)上，探索ScBD基因的多拷貝表達盒載體的構(gòu)建策略，并轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33細(xì)胞后篩選優(yōu)質(zhì)的重組菌株；通過實時定量PCR(qRT-PCR)分析和比較各重組菌株基因組中目的基因的拷貝數(shù)，以考察重組載體所含的表達盒數(shù)量與目的基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系，擬篩選到含高拷貝目的基因并具高轉(zhuǎn)錄水平的重組畢赤酵母菌株，為實現(xiàn)重組ScBD的高表達量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α購自天根生化科技有限公司(北京)；表達載體pPICZαA和畢赤酵母(Pichiapastoris)X-33購自Invitrogen公司(美國)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso plus試劑、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、同尾酶(BamHI、BglII)和T4DNA連接酶購自TaKaRa公司(日本)；PCR反應(yīng)試劑、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和酵母基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)；qRT-PCR試劑ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自諾唯贊生物科技有限公司(南京)。引物合成、DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。大腸埃希菌LB培養(yǎng)基、畢赤酵母YPDS培養(yǎng)基見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 梯度PCR(T100，美國Bio-rad公司)，電泳儀(JY300C，美國Bio-rad公司)，ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR(7500 Fast，美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 鱖魚β-防御素的結(jié)構(gòu)分析 使用Bio Edit version7.0.9將ScBD的氨基酸序列與其他魚種的β-防御素氨基酸序列進行多重比對；使用MEGA X的臨位相聯(lián)法(Neighbor-Joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，各結(jié)點的置信度由自引導(dǎo)值估計，重復(fù)次數(shù)為1 000；使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)、SWISS MODEL建模服務(wù)器(https://swissmodel.expasy.org/)和PyMOL軟件對鱖魚β-防御素的二級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

1.2.2 鱖魚β-防御素基因的多拷貝表達盒載體的構(gòu)建 多表達盒載體的構(gòu)建如圖1所示。首先通過RT-PCR獲得來自鱖魚脾臟的編碼β-防御素成熟肽的cDNA，經(jīng)PCR在其5′端添加XhoI限制性位點和Kex2信號肽酶切位點、3′端添加XbaI限制性位點和6×His標(biāo)簽以及2個終止密碼子后，獲得目的片段ScBD，將其與表達載體pPICZA連接后獲得重組表達載體pPICZA-ScBD(命名為pPICZA-ScBD1)；用同尾酶BamHI和BglII對pPICZA-ScBD1進行雙酶切，酶切體系和條件：pPICZαA-ScBD170 μL﹑10×H Buffer 10 μL、BamHI(15 U/μL)5 μL、BglII(10 U/μL)5 μL，無菌水補足至100 μL，37 ℃酶切反應(yīng)8 h；酶切混合液用于瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收一段包含醇氧化酶基因啟動子(5′AOX1)、α-信號肽因子(α-factor)、目的基因(ScBD)和醇氧化酶基因終止子(3′AOX1)的順式作用元件，同時，使用BamHI對pPICZαA-ScBD1進行酶切，獲得的線性片段與上述表達盒片段按1∶10(體積比)混合，在T4DNA連接酶作用下37 ℃孵育1 h，然后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取適量菌液涂布于含25 μg/mL 博萊霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)至單菌落產(chǎn)生。通過雙酶切和單酶切對含二拷貝表達盒的重組表達載體pPICZαA-ScBD2進行鑒定。按照上述酶切體系和條件，用BamHI和BglII對pPICZαA-ScBD2進行雙酶切，獲得二拷貝的表達盒片段，將其與用BamHI酶切過的線性化的pPICZαA-ScBD2連接，獲得含四拷貝表達盒的重組表達載體pPICZαA-ScBD4，用同樣的方法對其進行鑒定。

圖1 ScBD基因的多拷貝表達盒載體的構(gòu)建策略圖Fig.1 Schematic representation of the recombinant vectors harboring multi-copy expression cassette for ScBD gene

1.2.3 重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建和鑒定 使用BglII對pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4)進行線性化處理后，分別與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞以1∶8(體積比)混合，轉(zhuǎn)入0.2 cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中冰浴5 min，電擊(2 kV，25 μF，200 Ω)后，立即加入1 mL 1 mol/L山梨醇，30 ℃放置1.5 h；離心取菌體涂布于含100 μg/mL博來霉素的YPDS平板，29 ℃培養(yǎng)至單菌落產(chǎn)生。另外，將空載體pPICZαA轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中作為陰性對照。選擇YPDS平板上長勢良好的酵母菌菌落提取其基因組DNA，以此為模板，用pPICZαA載體上的通用引物5′AOX1(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)和3′AOX1(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)以及來源于目的基因序列的引物“ScBDR2”(5′-ATGATGATGATGATGATGAGACCGCATAGCACAG-3′)進行PCR鑒定。

1.2.4 目的基因拷貝數(shù)的定量 參考qRT-PCR檢測酵母轉(zhuǎn)化子基因拷貝數(shù)的方法[16]。使用線性化的pPICZαA-ScBD1作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用多功能酶標(biāo)儀測得pPICZαA-ScBD1的濃度為174.256 ng/μL后，根據(jù)以下公式計算pPICZαA-ScBD1的拷貝數(shù)[12]：

以10倍稀釋度依次進行7個梯度的稀釋；以Ct值(Cycle threshold，循環(huán)閾值)為縱坐標(biāo)、模板拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system進行qRT-PCR，反應(yīng)體系和條件：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL、引物ScBDF1(5′-ACATGTGGGTATAGAGGAC-3′)和ScBDR1(5′-CTGTATCTTCGAGGGCAAC-3′)(10 μmol/L)各0.4 μL、重組菌株基因組DNA(70 ng/μL)2 μL，無菌水補足至20 μL；95 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；以ddH2O為模板作為陰性對照，每組重復(fù)3次，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值計算每個樣品中ScBD基因的拷貝數(shù)，使用7500 software v 2.0.6和SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱖魚與其他魚種之間β-防御素初級結(jié)構(gòu)的比較

如圖2所示，不同魚種的β-防御素成熟肽的初級結(jié)構(gòu)中均包括氨基端高度疏水區(qū)域和羧基端富含半胱氨酸的正電區(qū)域；羧基端的6個高度保守的半胱氨酸殘基在空間上能形成3對二硫鍵，對β-防御素的穩(wěn)定性起了關(guān)鍵作用[17]。此外，鱖魚與點帶石斑魚之間的β-防御素氨基酸序列同源性最高(95.2%)，而與香魚(Plecoglossusaltivelis)之間的同源性最低(35.0%)；這種初級結(jié)構(gòu)的差異也可能導(dǎo)致了不同魚種的β-防御素在空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性方面的差異。

圖2 鱖魚與其他魚種之間β-防御素氨基酸序列的多重比較Fig.2 Comparison of β-defensin amino acid sequences between Siniperca chuatsi and other fish speciesa、b分別為信號肽序列和成熟肽序列；方框表示半胱氨酸殘基；*表示一致性The a and b are signal peptide and mature peptide sequences, respectively;Boxes represent cysteine residues; * represents identity of amino acids

2.2 基于鱖魚和其他物種β-防御素氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹分析

由圖3可見，基于不同物種的β-防御素氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹可分為3大支，分別為魚類、哺乳類和鳥類。其中，魚類包括2個分支，一大分支由同為鯉科魚類的鯉魚(Cyprinuscarpio)和斑馬魚同工型3組成，另一分支由鱖魚、點帶石斑魚、紅尾圓鳉(Nothobranchiusguentheri)、大西洋雪魚、褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)和斑馬魚同工型2組成?？梢园l(fā)現(xiàn)，屬真鱸科的鱖魚與屬鮨科的點帶石斑魚之間顯示了更近的親緣關(guān)系(自引導(dǎo)值=91)，這與上述β-防御素氨基酸序列多重比較的結(jié)果相一致。

圖3 基于鱖魚和其他物種β-防御素氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree based on amino acid sequences of β-defensin from Siniperca chuatsi and other species

2.3 鱖魚β-防御素的構(gòu)象單元和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈局部肽段的構(gòu)象，它們是完整三級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)單元，也稱為構(gòu)象單元，是蛋白質(zhì)復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。經(jīng)SOPMA預(yù)測，鱖魚β-防御素的構(gòu)象單元主要包含β-片層、伸展鏈和無規(guī)則卷曲，這些構(gòu)象單元組合起來構(gòu)成了ScBD的三維結(jié)構(gòu)。鑒于PDB(Protein Data Bank，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)數(shù)據(jù)庫中已有的人源β-防御素104與ScBD的氨基酸序列同源性為48.39%，繼而通過同源建模法并經(jīng)PyMOL軟件預(yù)測，獲得ScBD的三維結(jié)構(gòu)(圖4)，可以發(fā)現(xiàn)，Cys10-Cys38(紅色)、Cys20-Cys39(藍色)和Cys16-Cys32(綠色)3對二硫鍵形成時，每對二硫鍵的1個半胱氨酸殘基位于β-片層內(nèi)；而另1個半胱氨酸殘基位于loop或伸展鏈內(nèi)，這樣的二硫鍵形成方式非常有利于β-防御素空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

圖4 ScBD的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the spatial structure for ScBD Cys10、Cys16、Cys20、Cys32、Cys38和Cys39分別表示位于多肽鏈不同位置的半胱氨酸殘基；紅色、綠色和藍色分別表示3對二硫鍵Cys10，Cys16，Cys20，Cys32，Cys38 and Cys39 represent cysteine residues located in different location of the polypeptide chain respectively; red, green and blue represent three pairs of disulfide bond, respectively

2.4 多拷貝表達盒載體的鑒定

BamHI和BglII作為同尾酶，經(jīng)其雙酶切后的DNA片段與經(jīng)BglII或BamHI單酶切后的DNA片段連接后，連接處的序列不能再被BglII或BamHI識別。因此，經(jīng)這兩種同尾酶雙酶切后的表達盒片段(一拷貝或二拷貝)能夠與經(jīng)BamHI單酶切后的重組表達載體pPICZαA-ScBDn(n=1或2)連接，并在連接方向正確(表達盒片段的5′AOX1末端與單酶切后載體上的3′AOX1末端連接)的情況下獲得僅含有一個有效BamHI或BglII單酶切位點的pPICZαA-ScBDn(n=2或4)，便于之后的雙酶切處理和線性化處理?；谏鲜鎏攸c，可以通過同尾酶切割法考察pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4)是否構(gòu)建成功。如圖5A所示，使用BamHI和BglII對pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4)進行雙酶切后，釋放的3個片段分別位于近2 000、2 500～5 000和5 000～15 000 bp的分子量位置，分別與1 761、3 522和7 044 bp的理論值相符；另一方面，用BglII對pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4)進行單酶切后的結(jié)果如圖5B所示，酶切后釋放的3個片段分別在近5 000、5 000～10 000和近10 000 bp的分子量位置，分別與3 671、5 433和8 955 bp的理論值相符；上述結(jié)果初步證明已成功構(gòu)建含二拷貝和四拷貝表達盒的pPICZαA-ScBD2和pPICZαA-ScBD4表達載體。

圖5 pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4) 經(jīng)雙酶切(A)和單酶切(B)后的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.5 Agarose gel electrophoresis analysis for pPICZαA-ScBDn(n=1、2 or 4) digested with BglII and BamHI (A), and BglII (B)M1、M2：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～3：用BamHI和BglII 雙酶切后的pPICZ A-ScBDn(n=1、2或4)；4～6：用BglII酶切后的pPICZ A-ScBDn(n=1、2或4)M1, M2: DNA ladder; lanes 1-3: pPICZ A-ScBDn(n=1,2 or 4) digested with BamHI and BglII; lanes 4-6: pPICZ A-ScBDn(n=1,2 or 4) digested with BglII

2.5 重組畢赤酵母菌株的篩選及其ScBD基因拷貝數(shù)的確定

上述重組表達載體(pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4))分別電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33后，對3種重組菌株的基因組DNA進行PCR鑒定，結(jié)果如圖6所示，使用5′AOX1和3′AOX1為引物，3種重組菌株均擴增到近700 bp處的片段，與理論分子量673 bp相符；而使用5′AOX1和ScBDR2為引物，均擴增到在500 bp處的片段，與488 bp的理論分子量相符。上述結(jié)果表明pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4)均已分別嵌合進畢赤酵母X-33基因組中，由此證明成功獲得重組畢赤酵母菌株。

圖6 含不同拷貝數(shù)表達盒載體的重組畢赤酵母菌株的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of recombinant P. pastoris strains harboring vectors with different number of expression cassettes M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～3：X-33/ pPICZα A-ScBDn(n=1,2或4)；a：5′AOX1和3′AOX1為引物擴增的PCR產(chǎn)物；b：5′AOX1和ScBDR2為引物擴增的PCR產(chǎn)物M: DNA ladder; lanes 1-3: X-33/ pPICZ A-ScBDn(n=1,2或4); a: PCR products amplified using 5′AOX1 and 3′AOX1 as primers; b: PCR products amplified using 5′AOX1 and ScBDR2 as primers

如果在三種重組畢赤酵母菌株(X-33/pPICZαA-ScBDn(n=1、2或4))的基因組DNA濃度相同的基礎(chǔ)上進行qRT-PCR擴增，則模板DNA中目的基因的拷貝數(shù)越多，熒光信號到達擴增閾值時的循環(huán)次數(shù)(Ct值)就越少，利用此特點可以測定3種重組菌株到達擴增閾值的Ct值，以確定整合進畢赤酵母基因組中的ScBD基因拷貝數(shù)。圖7A顯示的是基于qRT-PCR的ScBD基因的拷貝數(shù)與Ct值之間的相關(guān)關(guān)系，呈明顯的線性相關(guān)；隨著ScBD基因拷貝數(shù)的增加，Ct值在不斷的減小，即pPICZαA-ScBDn(n=2或4)總是比前者pPICZαA-ScBDn(n=1或2)提前達到熒光信號閾值。一拷貝、二拷貝和四拷貝表達盒載體的Ct值分別是21.41、20.21和19.06，說明含表達盒數(shù)量越多的重組載體可以使整合進畢赤酵母基因組中的ScBD基因拷貝數(shù)越多。圖7B顯示了在含一拷貝、二拷貝和四拷貝表達盒載體的重組菌株的基因組中整合的ScBD基因的拷貝數(shù)分別為1.19×105、2.56×105和5.29×105，它們之間存在明顯的差異(P<0.05)。

圖7 基于qRT-PCR的ScBD基因定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)和ScBD 基因在各種重組菌株中的拷貝數(shù)(B)Fig.7 Standard curve of ScBD gene quantitative based on qRT-PCR (A) and ScBD gene copy number in various recombinant stains (B)●表示標(biāo)準(zhǔn)品；■表示重組菌株基因組；不同字母表示3種重組菌株的基因拷貝數(shù)之間具有顯著差異(P<0.05)，數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)● represents standard sample; ■ represents genome of recombinant strains; different letters indicate that there are statistical differences among the gene copy number of three recombinant strains (P<0.05), data were shown as mean ± SD (n=3)

3 討 論

β-防御素成熟肽的初級結(jié)構(gòu)中羧基端區(qū)域富含帶正電荷的精氨酸，而氨基端區(qū)域高度疏水；這樣的殘基分布特點有利于帶正電荷的羧基端吸引細(xì)菌細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的脂多糖，之后疏水性的氨基端插入細(xì)胞膜內(nèi)疏水區(qū)并破壞其通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)外泄，從而殺死細(xì)菌[18]。根據(jù)鱖魚與其他魚種之間β-防御素氨基酸序列的多重比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大部分魚種的β-防御素均具有上述結(jié)構(gòu)特征。此外，通過同源建模法獲得的鱖魚β-防御素的空間結(jié)構(gòu)中，6個高度保守的半胱氨酸殘基以“Cys10-Cys38、Cys20-Cys39和Cys16-Cys32”的連接方式形成3對穩(wěn)定的二硫鍵，以維持3股扭曲反向平行的β-片層和Loop結(jié)構(gòu)，這種高度穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)防止了β-防御素在富含蛋白酶的細(xì)胞環(huán)境中，仍能保持其生物學(xué)活性[19]。前期研究結(jié)果表明了重組鱖魚β-防御素具有抑制革蘭陰性的副溶血性弧菌的活性。

魚類β-防御素成熟肽的分子量一般為4.5～5.4 kD，通過重組DNA技術(shù)獲得的這種小分子量蛋白容易對宿主菌株產(chǎn)生潛在的危害，且可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞經(jīng)歷“自殺”現(xiàn)象[20]；另外，這種水分子蛋白也易被宿主自身產(chǎn)生的酶降解。因此，通過生物表達系統(tǒng)較難獲得高產(chǎn)的重組小分子蛋白質(zhì)。前期研究構(gòu)建的含單拷貝表達盒載體的重組畢赤酵母菌株(X-33/pPICZαA-ScBD)產(chǎn)ScBD的量僅為2.53 mg/L。近年來，通過構(gòu)建小分子肽多拷貝串聯(lián)表達盒載體提高蛋白質(zhì)表達量的方法已應(yīng)用于多種抗菌肽的異源表達[13-15]，據(jù)此，本研究擬通過構(gòu)建含多拷貝表達盒載體pPICZαA-ScBDn(n=2或4)的重組菌株，解決ScBD的低表達量問題。就構(gòu)建方法而言，有非對稱黏性末端互補法、接頭連接法、同尾酶法等，這些方法各具特點，在選擇構(gòu)建方法時須綜合考慮目的蛋白的分子量、構(gòu)象特征和二硫鍵數(shù)目等[21-22]。有研究表明，多聚體表達產(chǎn)物中二硫鍵出現(xiàn)錯配的概率會隨著半胱氨酸殘基的增加而增大，繼而降低產(chǎn)物的穩(wěn)定性[21]。鱖魚β-防御素雖然屬于小分子肽，但其初級結(jié)構(gòu)中含有6個半胱氨酸殘基，以致空間結(jié)構(gòu)中含3對二硫鍵，因此，本研究采用了同尾酶法構(gòu)建β-防御素基因的多拷貝表達盒載體(pPICZαA-ScBDn(n=2或4))，使每一個表達盒得以獨立表達目的蛋白，既避免了上述多聚體表達產(chǎn)物的問題，又增加了ScBD基因整合到酵母基因組中的拷貝數(shù)。通過qRT-PCR證明：就ScBD基因的拷貝數(shù)而言，X-33/pPICZαA-ScBD4約是X-33/pPICZαA-ScBD2的2倍、X-33/pPICZαA-ScBD2約是X-33/pPICZαA-ScBD1的2倍，表明重組菌株所含載體的表達盒數(shù)目與ScBD基因的拷貝數(shù)之間存在正相關(guān)關(guān)系。

近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，并非重組載體中表達盒的數(shù)目越多產(chǎn)物的表達量就越高，表達盒數(shù)目與產(chǎn)物表達量之間不存在明顯的線性關(guān)系，這可能與目的基因結(jié)構(gòu)、宿主分泌蛋白質(zhì)的能力和目的蛋白的穩(wěn)定性等因素有關(guān)[21-22]，也可能與表達機制有關(guān)。Liang等[15]構(gòu)建了含豬胰島素前體(por-cine insulin precursor, PIP)基因的3、6、12、18、29和52拷貝表達盒的重組畢赤酵母菌株，發(fā)現(xiàn)含12個表達盒的菌株產(chǎn)PIP的量最多；當(dāng)高于12時，PIP 的表達量呈下降趨勢。因此，進一步的研究將致力于構(gòu)建含更多表達盒的表達載體和實現(xiàn)在畢赤酵母中的表達，以探索宿主菌可以承受的最優(yōu)拷貝數(shù)。

本研究通過同源建模法預(yù)測了鱖魚β-防御素的空間結(jié)構(gòu)，顯示了其特有的3對二硫鍵對穩(wěn)定β-防御素的空間結(jié)構(gòu)具有關(guān)鍵性的作用。使用同尾酶法構(gòu)建了鱖魚β-防御素基因的多拷貝表達盒載體pPICZαA-ScBDn(n=2,4)，并電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33，成功篩選到重組菌株。qRT-PCR測定結(jié)果表明重組菌株所含載體的表達盒數(shù)目與ScBD基因的拷貝數(shù)之間存在正相關(guān)關(guān)系。