食管鱗癌組織ERCC1及SLC7A11的表達(dá)水平對(duì)新輔助化療療效的影響

劉建偉， 徐世宗， 李 立， 李建輝， 裴存文， 陳寶剛， 李建華

(河北省承德市中心醫(yī)院， 河北 承德 067000)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC)是中國(guó)和日本發(fā)病率較高的組織學(xué)亞型[1]。ESCC患者在發(fā)病早期臨床癥狀不典型，當(dāng)患者出現(xiàn)吞咽困難、飲水嗆咳等癥狀時(shí)多已發(fā)展至中晚期。目前，外科手術(shù)仍是治療ESCC的主要手段，對(duì)于早期患者，經(jīng)胸腹腔鏡切除可取得很好的療效，但是對(duì)于中晚期ESCC患者僅通過(guò)單純進(jìn)行外科手術(shù)治療效果欠佳，術(shù)后極易復(fù)發(fā)[2]。近年來(lái)，新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NAC)以縮小病灶面積，殺滅微轉(zhuǎn)移病灶、提高手術(shù)療效在各種惡性腫瘤中被廣泛應(yīng)用[3]。然而，腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物不敏感或耐藥是化療失敗的主要原因。因此，尋找化療敏感及耐藥靶點(diǎn)，對(duì)選擇化療方案，改善預(yù)后尤為關(guān)鍵。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(nucleotide excision repair crosscomplementary gene1,ERCC1)為化療耐藥基因[4]。SLC7A11過(guò)表達(dá)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH合成從而干擾氧化應(yīng)激，參于多種癌癥化療耐藥性[5]。本文通過(guò)檢測(cè)ESCC組織ERCC1和SLC7A11，分析其與患者臨床病理特征及新輔助化療療效的關(guān)系，旨在明確療效和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集承德市中心醫(yī)院心胸外科和腫瘤科2012年8月至2017年11月食管鱗癌新輔助化療及手術(shù)切除前病理標(biāo)本92例。36例食管正常黏膜組織(來(lái)源于食管良性病變胃鏡活檢組織，均已經(jīng)簽署知情同意書)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①治療前患者均經(jīng)食管鏡、CT、MRI及病理確診為食管鱗狀細(xì)胞癌，均為原發(fā)性食管鱗癌；②初次治療；③卡氏功能狀態(tài)評(píng)分≥80分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并嚴(yán)重心肺功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙等化療禁忌證；③無(wú)法接受隨訪?；颊呔炇饡嬷橥鈺?，經(jīng)承德市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。食管鱗癌組92例，男64例，女28例；年齡為36～77歲，平均年齡(56.81±7.28)歲；臨床分期：ⅠA 期11例,ⅠB期13例,ⅡA期21例，ⅡB期18例，ⅢA期29例。其中ⅠA期11例為早期ESCC，僅接受胸腹腔鏡手術(shù)，未進(jìn)行新輔助化療。其余81例患者以對(duì)新輔助化療敏感為敏感組共59例，耐藥組共22例，兩組患者的性別、年齡、臨床分期等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，具有可比性。

1.2新輔助化療方法:新輔助化療前所有患者均行常規(guī)體格、血常規(guī)以及生化常規(guī)等檢查，無(wú)化療禁忌證。81例患者均采用以順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶(PF方案)。順鉑60mg,每日兩次，d1～5；5-氟尿嘧啶750mg,每日兩次，d1～5；21d為1個(gè)化療周期，連續(xù)接受2個(gè)周期化療，化療結(jié)束2周后進(jìn)行手術(shù)治療。常規(guī)給予保護(hù)肝、護(hù)胃、止吐等對(duì)癥支持治療。

1.3食管鱗癌根治術(shù):81例患者接受食管鱗癌根治術(shù)：根據(jù)腫瘤不同的部位采取切口，手術(shù)安全界緣均大于腫瘤上下邊緣5cm，并切除腫瘤周圍纖維組織及淋巴結(jié)。

1.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)ERCC1和SLC7A11蛋白的表達(dá):標(biāo)本均來(lái)自食管鱗癌及對(duì)照組患者石蠟包埋的組織，切成4μm厚的組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)后，將切片室溫冷卻，10%山羊血清封閉，加單克隆抗ERCC1或多克隆抗體SLC7A11在4℃下孵育過(guò)夜，二抗孵育。DAB免疫染色，封片。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)代替一抗，為陰性對(duì)照。多克隆抗體SLC7A11購(gòu)自Abcam Biotechnology(1：500，Abcam公司，英國(guó))，單克隆抗體ERCC1和免疫組化試劑盒購(gòu)自中山金橋生物技術(shù)有限公司(中國(guó)北京市)。結(jié)果判斷由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行。ERCC1陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿。免疫組化染色密度：低倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別在高倍鏡下計(jì)數(shù)，每個(gè)視野100個(gè)癌細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)：76%為3分，取5個(gè)視野的平均數(shù)作為判定結(jié)果。染色強(qiáng)度：未見染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分，棕黑色為4分。陽(yáng)性表達(dá)綜合細(xì)胞陽(yáng)性密度與染色強(qiáng)度得分相加作為最終判定結(jié)果：<3分，為陰性；3～5分為陽(yáng)性；>6分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5隨訪92例患者建立隨訪檔案，每3個(gè)月進(jìn)行電話或門診隨訪，對(duì)局部復(fù)發(fā)、死亡等情況進(jìn)行登記，隨訪36～60個(gè)月。觀察患者3年的復(fù)發(fā)率及病死率。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌組織中ERCC1和SLC7A11的表達(dá)水平:ERCC1陽(yáng)性表達(dá)主要位于食管鱗癌細(xì)胞核，SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)主要位于食管鱗癌細(xì)胞膜及細(xì)胞漿(圖1)。食管鱗癌組ERCC1陽(yáng)性表達(dá)58例(63.0%)，食管正常黏膜組ERCC1陽(yáng)性表達(dá)11例(30.5%)；食管鱗癌組SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)47例(51.1%);食管正常黏膜組SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)9例(25.0%)。兩組ERCC1、SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為10.991、7.155，P均<0.01)，見圖1。

圖1 食管組織ERCC1和SLC7A1表達(dá)(×200)

2.2ERCC1及SLC7A11表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:食管鱗癌組與食管正常黏膜組ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率差異顯著(χ2=10.991，P<0.01)；食管鱗癌組中年齡、性別不同ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性(P>0.05)；食管鱗癌組中分期不同及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率差異有顯著性(P<0.05)；分化程度不同食管鱗癌組間比較后發(fā)現(xiàn)高分化組與中分化組/或低分化組比較P=0.003/0.002,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中分化和低分化組間比較P=0.543，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。食管鱗癌組與食管正常黏膜組SLC7A11表達(dá)陽(yáng)性率差異非常顯著(χ2=7.155，P<0.01);食管鱗癌組中年齡、性別不同SLC7A11表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性(P>0.05)；食管鱗癌組中分期不同及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SLC7A11表達(dá)陽(yáng)性率差異有顯著性(P<0.05)；分化程度不同食管鱗癌組中SLC7A11表達(dá)陽(yáng)性率差異有顯著性(P>0.05)，組間比較后發(fā)現(xiàn)高分化組與中分化組/或低分化組比較P=0.006/0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中分化和低分化組間比較P=0.268，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表1 食管鱗癌組織ERCC1 SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.3食管鱗癌組織中 ERCC1與SLC7A11表達(dá)的相關(guān)性:Pearson 相關(guān)分析顯示，ERCC1 表達(dá)水平與SLC7A11表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.357，P=0.001)，見表2。

表2 食管鱗癌組織中 ERCC1與SLC7A11表達(dá)的相關(guān)性

2.4食管鱗癌患者術(shù)后SLC7A11、ERCC1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系:92例食管鱗癌患者，隨訪36～60個(gè)月，其中術(shù)后3年復(fù)發(fā)21例,復(fù)發(fā)率為22.8%(21/92)。復(fù)發(fā)組中ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率為76.2%(16/21)，無(wú)復(fù)發(fā)組為59.1%(42/71)，二者差異有顯著性(P<0.05)。復(fù)發(fā)組中SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率為66.6%(14/21)，無(wú)復(fù)發(fā)組為46.5%(33/71)，復(fù)發(fā)組SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)復(fù)發(fā)組(P<0.05)；術(shù)后3年死亡13例,死亡率為14.1%(13/92)。死亡者中ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率為92.3%(12/13)，無(wú)死亡者為58.2%(46/79)，死亡組ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)死亡組，差異有顯著性(P<0.05)。死亡者中SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率為53.8%(7/13)，無(wú)死亡者為50.6%(40/79)，二者差異無(wú)顯著性(P>0.05)；Kaplan-Meier分析顯示食管鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)中ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)明顯高于ERCC1(+)/ SLC7A11(-)，ERCC1(-)/ SLC7A11(+)及ERCC1(-)/ SLC7A11(-)組，P<0.05，差異有顯著性。食管鱗癌患者術(shù)后生存ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)組明顯低于ERCC1(+)/ SLC7A11(-)、ERCC1(-)/ SLC7A11(+)及ERCC1(-)/ SLC7A11(-)各組，P<0.05，差異有顯著性，見圖2。

圖2 食管鱗癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存函數(shù)及總生存函數(shù)

2.5食管鱗癌接受新輔助化療ERCC1和SlC7A11表達(dá)情況:92例食管鱗癌患者，其中11例僅接受胸腹腔鏡手術(shù)未進(jìn)行新輔助化療，其余81例接受新輔助化療患者中，敏感組59例，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率為55.9%(33/59)，耐藥組22例，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率為90.9%(20/22)，二者差異顯著(P<0.05)；敏感者59例，SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率為45.7%(27/59)，耐藥組22例，SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率為72.7%(16/22)，二者差異顯著(P<0.05)，見表3。

表3 食管鱗癌接受新輔助化療患者ERCC1和SlC7A11表達(dá)情況(n)

3 討 論

新輔助化療因?yàn)槠湎麥缒[瘤患者早期出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移病灶，縮小原發(fā)腫瘤，縮小手術(shù)范圍，期望保留器官及其部分功能等優(yōu)點(diǎn)被臨床醫(yī)師廣泛接受。Ando等將330例II期或III期(T4除外)的食管鱗癌患者隨機(jī)分組，組1為單獨(dú)接受手術(shù)，組2為手術(shù)前使用兩個(gè)療程的順鉑加5-氟尿嘧啶，組1的5年總生存率為43%，組2為55%(P<0.05)，認(rèn)為術(shù)前用順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶化療可作為II/III期食管鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[6]。

鉑類藥物是新輔助化療藥物之一，該藥物通過(guò)與DNA結(jié)合形成Pt-DNA加合物，其活性過(guò)高可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在DNA合成后期或細(xì)胞分裂期，降低其修復(fù)細(xì)胞損傷的能力，ERCC1在DNA修復(fù)通路中發(fā)揮重要作用，具有對(duì)損傷基因片段的識(shí)別和切除修復(fù)功能，其表達(dá)的高低能反映整個(gè)DNA核酸切除修復(fù)活性的水平，可能是ERCC1蛋白高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤患者對(duì)鉑類化療藥物產(chǎn)生了耐藥的主要機(jī)制[7,8]。Ozcan等證實(shí)在接受鉑類NAC的膀胱癌患者中，認(rèn)為高ERCC1表達(dá)可作為膀胱癌不良預(yù)后的指標(biāo)[9]。潘婷婷等免疫組織化學(xué)方法對(duì)126例胃癌患者第1次胃鏡取檢和新輔助化療后行R0切除術(shù)的胃癌組織中ERCC1的表達(dá)水平與NAC敏感性關(guān)系的研究顯示，NAC前后ERCC1表達(dá)均與療效相關(guān)(均P<0.05)，ERCC1的表達(dá)是胃癌患者NAC療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[10]。本研究中食管鱗癌組ERCC1高表達(dá)與對(duì)照組相比呈顯著差異(P<0.05)；81例食管鱗癌患者接受新輔助化療患者中，敏感組59例，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率為55.9%(33/59)，耐藥組22例，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率為90.9%(20/22)，兩組表達(dá)差異顯著(P<0.05)；表明ERCC1的高表達(dá)可預(yù)測(cè)食管鱗癌患者NAC的療效。

SLC7A11參與多種腫瘤的耐藥研究已經(jīng)廣泛進(jìn)行。卵巢癌(OC)患者由于耐藥而預(yù)后較差，Yin等應(yīng)用基于微陣列方法鑒定131個(gè)基因與OC耐藥性和預(yù)后的因素相關(guān)，發(fā)現(xiàn)90個(gè)基因與鉑耐藥性相關(guān)，其中SLC7A11是OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。Horibe等通過(guò)逐步增加順鉑(CDDP)濃度至4和20μM，建立了人類肺癌A549細(xì)胞衍生的低級(jí)和高級(jí)CDDP耐藥亞系，稱為ACR4和ACR20細(xì)胞，ACR4和ACR20細(xì)胞對(duì)CDDP的抵抗力分別比A549細(xì)胞高6到16倍，通過(guò)特異性siRNA抑制SLC7A11 mRNA可顯著提高A549，ACR4和ACR20細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性，導(dǎo)致CDDP耐藥[12]。提示SLC7A11對(duì)化療藥物敏感和耐藥起到重要作用。本研究中食管鱗癌組SLC7A11蛋白高表達(dá)，與對(duì)照組相比呈顯著差異(P<0.05))；81例食管鱗癌患者接受新輔助化療患者中，敏感組59例，SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率為45.7%(27/59)，耐藥組22例，SLC7A11陽(yáng)性表達(dá)率為72.7%(16/22)，二者差異顯著(P<0.05)，表明SLC7A11的高表達(dá)可預(yù)測(cè)食管鱗癌患者NAC的療效較差。

目前國(guó)內(nèi)在ERCC1聯(lián)合SLC7A11表達(dá)能否對(duì)食管鱗癌患者新輔助化療療效影響和預(yù)測(cè)預(yù)后的文獻(xiàn)報(bào)道缺乏。本研究食管鱗癌組中ERCC1及SLC7A11蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)(P<0.01)。92例食管鱗癌患者，術(shù)后3年復(fù)發(fā)21例，Kaplan-Meier分析顯示術(shù)后復(fù)發(fā)中ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)明顯高于ERCC1(+)/ SLC7A11(-)，ERCC1(-)/ SLC7A11(+)及ERCC1(-)/ SLC7A11(-)組，P<0.05，差異有顯著性；術(shù)后3年死亡13例,死亡組中ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)明顯高于其余組， P<0.05，差異有顯著性。結(jié)果表明，ERCC1(+)/ SLC7A11(+)食管鱗癌患者對(duì)新輔助化療容易發(fā)生耐藥，且預(yù)后較差。

綜上所述本研究提示ERCC1(+)/SLC7A11(+)對(duì)食管鱗癌術(shù)后復(fù)發(fā)、生存及新輔助化療療效的判斷有重要意義。食管鱗癌威脅人們的健康安全，以此作為靶點(diǎn)在分子層面的深入研究有望提高食管鱗癌對(duì)新輔助化療敏感性提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)提高食管鱗癌治療療效有重要意義。