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    右美托咪定通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)肝葉切除術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知功能障礙大鼠海馬神經(jīng)元自噬的影響*

    2021-06-30 01:04:12程亮亮田毅譚義文王丹
    西部醫(yī)學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:象限海馬批號(hào)

    程亮亮 田毅 譚義文 王丹

    (中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬??卺t(yī)院麻醉科,海南 海口 570208)

    術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知功能障礙(Post-operative neurocognitive dysfunction,PNCD)是老年麻醉手術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,具有記憶受損、認(rèn)知功能異常等表現(xiàn),影響疾病恢復(fù)進(jìn)程,甚至?xí)l(fā)展為老年癡呆,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前,臨床尚無有效防治PNCD的手段,部分藥物通過減輕全身炎癥或營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)治療效,但果仍不理想[2-3]。臨床研究表明,臨床常用吸入麻醉藥物,如七氟醚、氟烷等,具有誘導(dǎo)迅速、無明顯蓄積、蘇醒快等優(yōu)點(diǎn),但高濃度藥物仍會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)功能造成損傷,尤其是老齡人群廣泛存在腦組織功能退化,麻醉術(shù)后PNCD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高[4-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[6-7],七氟醚吸入麻醉可能通過激活海馬神經(jīng)元自噬引起海馬神經(jīng)元損傷,具有一定神經(jīng)毒性作用。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)屬于高選擇性α2腎上腺素能受體(α2 adrenergic receptor,α2-AR)激動(dòng)劑,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用,常于老年患者麻醉誘導(dǎo)前用藥,以穩(wěn)定誘導(dǎo)過程中血流動(dòng)力學(xué),輔助全身麻醉[8-9]。近年來,有報(bào)道認(rèn)為DEX可預(yù)防老年非心臟手術(shù)患者術(shù)后PNCD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),但具體影響機(jī)制尚不明確[10]。鑒于此,本研究在七氟醚麻醉下采用肝葉部分切除術(shù)建立PNCD大鼠模型,模擬腹腔術(shù)后神經(jīng)功能損傷,觀察不同劑量DEX通過自噬信號(hào)通路磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)對(duì)老年P(guān)NCD大鼠神經(jīng)功能的影響,為DEX臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20090248,規(guī)格2 mL:200 μg,批號(hào):10081435),七氟醚(湖北廣奧生物科技有限公司,批號(hào):6120104),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司,批號(hào):D31145791),兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)單抗(批號(hào):ab11362)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)單抗(批號(hào):ab12054)、磷酸化Akt(phosphorylation of Akt,p-Akt)多抗(批號(hào):ab37159)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)單抗(批號(hào):ab60218)、自噬標(biāo)記蛋白Beclin-1(批號(hào):ab55140)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(light chain 3,LC3,批號(hào):ab12194)(一抗,美國(guó)Abcam公司),山羊抗兔PI3K(批號(hào):ab13446)、Akt(批號(hào):ab20137)、p-Akt(批號(hào):)、mTOR(批號(hào):ab32194)、Beclin-1(批號(hào):ab01510)、LC3(批號(hào):ab00120)(二抗,美國(guó)Abcam公司)。

    1.2 主要儀器 CM-120型透射電鏡(荷蘭PHILIPS公司),Morris水迷宮及其配套圖像采集分析系統(tǒng)(北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司),3550UV酶標(biāo)儀、7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電泳儀、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,18月齡,體質(zhì)量(600±100)g,購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所,許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0001,飼養(yǎng)條件:室溫(24±1)℃,60%濕度,12 h/12 h晝夜節(jié)律照明,2只/籠飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食。

    1.4 方法

    1.4.1 動(dòng)物分組及干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)表法將50只SD大鼠分為5組:對(duì)照組、模型組、DEX低、中、高劑量組5組。模型組吸入3%七氟醚麻醉;DEX低、中、高劑量組分別預(yù)先腹腔注射25、50、100 μg/kg右美托咪定(按照人與動(dòng)物體表面積換算法換算臨床等效劑量為6.3 μg/kg,DEX低、中、高劑量分別約為4倍、8倍、16倍臨床等效劑量),30 min后3組均吸入3%七氟醚麻醉。各組大鼠麻醉后,參照文獻(xiàn)[11]均進(jìn)行部分肝葉切除術(shù),建立PNCD大鼠模型,Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比差異顯著,即為建模成功。對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水2 mL/kg,持續(xù)麻醉2 h(手術(shù)均結(jié)束)。

    1.4.2 修正神經(jīng)功能缺損程度(neurological severity score,NSS)評(píng)估 術(shù)后1、3、7 d采用NSS評(píng)分量表[12]對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)估,包括提尾、行走、感覺、平衡、反射5個(gè)試驗(yàn)內(nèi)容,每個(gè)試驗(yàn)評(píng)分3、3、2、6、4分,總分18分,分?jǐn)?shù)越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

    1.4.3 認(rèn)知功能評(píng)估 采用Morris水迷宮試驗(yàn)[13]對(duì)各組大鼠認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估:水迷宮直徑1.5 m、水深0.75 m、控制水溫(25±1)℃,將水池分為4個(gè)象限,安全島置于第I象限,水下1 cm,宮體正上方攝像頭可記錄運(yùn)動(dòng)軌跡,固定4各入水點(diǎn)和固定實(shí)驗(yàn)時(shí)間。術(shù)后第7 d開始進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1次,實(shí)驗(yàn)分兩部分:①術(shù)后第8~11 d定位巡航試驗(yàn),隨機(jī)選取某1象限入水點(diǎn),大鼠面對(duì)宮壁輕放入池,開始計(jì)時(shí),記錄60 s內(nèi)找到并登陸安全島的時(shí)間,即逃避潛伏期;若60 s內(nèi)未找到安全島,由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)大鼠至安全島,并停留30 s,逃避潛伏期記錄為60 s。每個(gè)象限入水1次/d,共入水4次/d,每次間隔2 h。②術(shù)后第12 d進(jìn)行空間探索試驗(yàn),撤去安全島,隨機(jī)選擇入水點(diǎn),記錄60 s內(nèi)的游泳軌跡,統(tǒng)計(jì)目標(biāo)象限游泳距離占比,即大鼠在目標(biāo)象限(第I象限)內(nèi)的游泳距離/總游泳距離×100%。

    1.4.4 海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后,立即處死各組大鼠,冰凍手術(shù)臺(tái)迅速取出腦組織,取左側(cè)海馬組織,修整為邊長(zhǎng)為1 cm的組織塊,放置于4%戊二醛中固定4 h,然后放置1%鋨酸固定30 min,脫水后樹脂包埋,制作厚度為50 nm切片,進(jìn)一步醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙染色,透射電鏡下觀察、拍照,計(jì)數(shù)自噬小體數(shù)目。

    1.4.5 海馬PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA檢測(cè) 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后,處死大鼠后取部分右側(cè)海馬組織,剪碎后提取組織中取總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)含量,逆轉(zhuǎn)錄法獲得互補(bǔ)鏈脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),經(jīng)鑒定后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR),反應(yīng)體系:Taq酶 11.5 μL,上下游引物各1.0 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 9.5 μL;反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性20 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,重復(fù)35個(gè)循環(huán)。以β-actin為管家基因,2-△△CT為目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度,重復(fù)3次取Ct平均值。引物序列,見表1。

    表1 引物序列Table 1 Primer sequence

    1.4.6 海馬PI3K、pAkt、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3-II、LC3-I蛋白檢測(cè) 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后,處死大鼠后取部分右側(cè)海馬組織,加入液氮研磨,加入細(xì)胞裂解液,沸水浴8~10 min,12000 r/min離心15 min,取上清液,蛋白定量后,取40 μg樣品于上樣緩沖液混勻,沸水浴3 min,再次離心收集上清液,然后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳,電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜60 min,加入封閉液搖床2 h(室溫),洗滌后加入一抗(1∶1000),搖床孵育過夜(4℃),洗滌后二抗(1∶8000),孵育60 min(常溫),暗室中曝光,并于凝膠成像系統(tǒng)中掃描,進(jìn)行灰度值分析,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損程度對(duì)比 術(shù)后50只大鼠均存活。DEX各劑量組NSS評(píng)分術(shù)后3 d、7 d均低于模型組,其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組,但仍高于對(duì)照組(P<0.05);DEX各劑量組術(shù)后NSS評(píng)分均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(P<0.05),模型組術(shù)后7 d較術(shù)后3 d稍有降低,但較術(shù)后1 d仍較高(P<0.05),而對(duì)照組無明顯變化,見表2。

    表2 NSS評(píng)分對(duì)比Table 2 Comparison of NSS scores

    2.2 逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳距離占比對(duì)比 DEX各劑量組術(shù)后9~11 d逃避潛伏期均短于模型組,其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組,但仍長(zhǎng)于較對(duì)照組(P<0.05);對(duì)照組、3劑量組逃避潛伏期隨時(shí)間而縮短(P<0.05),而模型組無明顯變化。DEX各劑量組目標(biāo)象限游泳距離占比均高于模型組,其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組,但仍低于對(duì)照組(P<0.05),見表3。

    表3 逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳距離占比對(duì)比Table 3 Comparison of escape latency and target quadrant swimming distance

    2.3 海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡觀察結(jié)果顯示,對(duì)照組未觀察到自噬小體,模型組自噬小體廣泛存在(8.20±0.94)個(gè)/視野,形態(tài)多樣化,可見雙層膜包裹的顆粒狀細(xì)胞質(zhì)或退化細(xì)胞器。DEX各劑量組自噬小體數(shù)量減少,DEX低、中、高劑量組分別為(5.58±0.50)個(gè)/視野、(4.22±0.37)個(gè)/視野、(2.07±0.24)個(gè)/視野;DEX各劑量組自噬小體數(shù)目均少于模型組,其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組,但仍多于對(duì)照組(P<0.05),見圖1。

    圖1 透射電鏡下海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)圖片(×12 K)Figure 1 Ultrastructural picture of hippocampal neurons under transmission electron microscopy注:Ly.溶酶體;M.線粒體;N.細(xì)胞核;紅色箭頭為自噬小體

    2.4 海馬PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA表達(dá)對(duì)比 DEX各劑量組PI3K、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組,其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組,但仍低于對(duì)照組(P<0.05);DEX各劑量組Beclin-1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組,其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組,但仍高于對(duì)照組(P<0.05),Akt mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

    圖2 PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)比Figure 2 Comparison of relative expressions of PI3K,Akt,mTOR,Beclin-1 and LC3 mRNA

    2.5 海馬PI3K、mTOR、Beclin-1蛋白表達(dá)及pAkt/Akt、LC3-II/LC3-I對(duì)比 DEX各劑量組PI3K、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量、pAkt/Akt均高于模型組,其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組,但仍低于對(duì)照組(P<0.05);DEX各劑量組Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量、LC3-II/LC3-I均低于模型組,其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組,但仍高于對(duì)照組(P<0.05),見圖3。

    圖3 海馬PI3K、Akt、pAkt、mTOR、Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白表達(dá)(n=4,F(xiàn)igure 3 Expressions of PI3K,Akt,pAkt,mTOR,Beclin-1,LC3-I and LC3-II in hippocampus 注:與對(duì)照組比,①P<0.05;與模型組比,②P<0.05;與DEX低劑量組比,③P<0.05;DEX中劑量組比,④P<0.05注:與對(duì)照組比,①P<0.05;與模型組比,②P<0.05;與DEX低劑量組比,③P<0.05;DEX中劑量組比,④P<0.05

    3 討論

    中樞神經(jīng)功能損害屬于麻醉手術(shù)后常見并發(fā)癥,臨床多表現(xiàn)為記憶、學(xué)習(xí)、認(rèn)知功能異常等,可能持續(xù)數(shù)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間[14-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[16-17],麻醉及手術(shù)應(yīng)激可引起PNCD,其多能自行恢復(fù),但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)仍會(huì)造成一定損傷。PNCD發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,涉及多種蛋白質(zhì)表達(dá)及信號(hào)通路調(diào)控作用,最終可引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡。DEX屬于美托嘧啶的異構(gòu)體,其作用機(jī)制為通過激動(dòng)腦脊髓中α2-AR而發(fā)揮鎮(zhèn)靜、止痛和抗交感作用,且已有研究證實(shí)DEX對(duì)多種腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[18-20]。

    水迷宮定位巡航和空間探索實(shí)驗(yàn)可評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能。尋找休息場(chǎng)所是動(dòng)物本能,該過程可反應(yīng)出大鼠對(duì)復(fù)雜信息的采集、整合和學(xué)習(xí)能力,尋找目標(biāo)象限完成度與海馬區(qū)結(jié)構(gòu)和功能、中樞神經(jīng)功能損害等關(guān)系密切[21]。本研究采用麻醉下行部分肝葉切除術(shù)法制備PNCD大鼠模型,模擬臨床剖腹手術(shù)對(duì)機(jī)體神經(jīng)功能的影響,術(shù)后采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),逃避潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組,目標(biāo)象限游泳距離占比短于對(duì)照組,提示麻醉下行部分肝葉切除術(shù)法制備PNCD成功。DEX可有效抑制交感神經(jīng)興奮,激活突觸前膜α2-AR(α1∶α2=1∶1600)[22],繼而負(fù)反饋抑制突觸后膜興奮,降低交感神經(jīng)興奮性。魏曉等[23]研究發(fā)現(xiàn),麻醉前應(yīng)用DEX有助于維持圍術(shù)期血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定,降低PNCD發(fā)生率,與本研究結(jié)果相似。本研究對(duì)PNCD大鼠術(shù)前應(yīng)用不同劑量DEX干預(yù),術(shù)后NSS評(píng)分低于模型組,逃避潛伏期均短于模型組,但仍長(zhǎng)于對(duì)照組,目標(biāo)象限游泳距離占比均高于模型組,但仍低于對(duì)照組,且均具有劑量依賴性,由此可知,DEX對(duì)減輕老年大鼠PNCD神經(jīng)功能損傷有積極意義。

    動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),老年大鼠術(shù)后海馬部位常出現(xiàn)萎縮、體積減小現(xiàn)象[24],進(jìn)一步研究顯示可能與海馬神經(jīng)元死亡有關(guān)。自噬是海馬神經(jīng)元主要死亡形式,本研究中透射電鏡顯示模型組自噬小體廣泛存在,七氟醚麻醉下行肝葉切除術(shù)后大鼠海馬神經(jīng)元確有損傷。自噬屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,Beclin-1、LC3均屬于自噬調(diào)控蛋白,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大、Beclin-1表達(dá)增加均與自噬體形成正相關(guān)[25]。PI3K屬于異源二聚體,Akt是其下游效應(yīng)因子,當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞表面后,PI3K激活,Akt膜轉(zhuǎn)位磷酸化激活,細(xì)胞內(nèi)磷酸化的Akt通過活化下游靶基因發(fā)揮效應(yīng)[26-27]。mTOR屬于細(xì)胞分裂及合成的調(diào)控中心,多種信號(hào)均可通過I型PI3K/Akt傳遞至mTOR啟動(dòng)靶點(diǎn)復(fù)合體1(TORC1),達(dá)到激活閾值后阻滯細(xì)胞分裂信號(hào)傳遞[28-29]。王建偉等[30]研究顯示,DEX可通過上調(diào)mTOR蛋白、下調(diào)LC3-II蛋白表達(dá)減輕大鼠立體肺缺血再灌注損傷引起的自噬,與本研究結(jié)果相似。本研究中模型組PI3K、mTOR mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量、pAkt/Akt均低于對(duì)照組,Beclin-1 mRNA和蛋白、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量、LC3-II/LC3-I高于對(duì)照組,提示PNCD大鼠海馬組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路處于抑制狀態(tài),自噬相關(guān)基因和蛋白異常高表達(dá)。進(jìn)一步應(yīng)用不同劑量DEX干預(yù)后,PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活,自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)被抑制,提示PNCD大鼠存在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制,使老年大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,但DEX可逆轉(zhuǎn)該信號(hào)通路的抑制作用,從而減輕海馬神經(jīng)元自噬,改善神經(jīng)功能損傷。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果顯示,DEX可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路減輕七氟醚麻醉下肝葉切除術(shù)老年大鼠神經(jīng)功能損傷,并抑制海馬神經(jīng)元自噬,可為臨床中應(yīng)用DEX預(yù)防老年人群麻醉術(shù)后神經(jīng)功能損傷提供理論支持,但其是否存在其他調(diào)控通路發(fā)揮作用仍需要進(jìn)一步探討。

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