Rho激酶抑制劑對(duì)腦梗死模型大鼠抗炎作用及TLR4/TRIF通路的影響

郭春保 張毅 周文芳 王興

(三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院·國藥葛洲壩中心醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科；2.重癥醫(yī)學(xué)科；3.心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443002)

腦梗死主要因腦組織區(qū)域出現(xiàn)供血不足、在缺血和缺氧條件下造成腦組織病變或壞死而形成的，其發(fā)病機(jī)制有很多種，主要的發(fā)病原因是動(dòng)脈粥樣硬化[1-2]。腦梗死中最常見的類型為血栓形成性腦梗死，腦動(dòng)脈主干和皮質(zhì)支動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔狹窄或閉塞是血栓形成性梗死的主要表現(xiàn)。腦梗死致殘率和病死率高，容易復(fù)發(fā)，是危害人類健康常見的疾病[3-4]。目前臨床對(duì)于腦梗死的治療可在一定程度上改善患者臨床癥狀，但多數(shù)患者預(yù)后不良，較易出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙等不良事件的發(fā)生。Rho激酶抑制劑可改善腦部供血狀態(tài)、降低血腦屏障和血脊髓屏障的通透性。還可以抑制細(xì)胞的死亡和減輕體外谷氨酸的神經(jīng)興奮毒性?；诖吮尘?，為改善腦梗死患者預(yù)后，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，將Rho激酶抑制劑應(yīng)用于腦梗死模型大鼠的干預(yù)治療中，以并觀察大鼠神經(jīng)功能和抗炎因子，明確Rho激酶抑制劑改善大鼠神經(jīng)功能和抗炎作用，為臨床上腦梗死的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD健康大鼠45只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，鼠齡(3.6±0.5)個(gè)月，體重(222.8±10.6)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫(22.1±2.0)℃，相對(duì)濕度38%～42%，每天光照12h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間一周。本文研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：Rho激酶抑制劑(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：155558-32-0)；水合氯醛(上海士鋒生物科技有限公司，貨號(hào)：302-17-0)；大鼠抗小鼠TLR4抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：K003881P)；兔抗大鼠TRIF抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司，貨號(hào)：253451)；兔抗大鼠TRAM抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào)：FNab10225)。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模 隨機(jī)選取45只大鼠中15只作為空白組，另外30只大鼠參照卞鑫等[5]研究實(shí)驗(yàn)中采用線栓法建立腦梗死模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后將它以仰臥位的姿勢擺放，做頸正中切口后將右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈進(jìn)行分離。頸外動(dòng)脈結(jié)扎離斷后，用縫線將頸總動(dòng)脈近端結(jié)扎，用動(dòng)脈夾將遠(yuǎn)端夾閉，在頸動(dòng)脈分叉處做一個(gè)小切口，將尼龍線栓經(jīng)切口插入并松開動(dòng)脈夾，慢慢向前推進(jìn)約18～20mm，遇到阻力后停止，把血管外的線栓剪斷，縫合切口建模成功。最終30只大鼠中27只模型建立成功，建模成功率為90%，將建模成功的27只大鼠隨機(jī)分為模型組14只、給藥組13只。

1.2.2 給藥 在建模成功后給藥組大鼠腹腔注射Rho激酶抑制劑(法舒地爾)15mg/kg，空白組和模型組腹腔注射等容量生理鹽水。

1.2.3 切片及染色 采用斷頭法處死大鼠，立即取大鼠腦組織，將提取的組織制作標(biāo)本，使用40mL/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3μm的組織切片，之后行HE染色處理，使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腦組織變化。

1.2.4 BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平檢測 抽取3組大鼠尾部靜脈血3mL，以離心半徑5cm、轉(zhuǎn)速3000r/min離心處理10min，分離上層血清，-80℃保存待檢。BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測，將血清樣本置于室溫后，取出試劑盒，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測血清及標(biāo)準(zhǔn)品100μL/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2h；用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100μL/孔以終止反應(yīng)，在450nm波長(參考波長570-630nm)測定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平成正比，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平。

1.2.5 TLR4/TRIF通路蛋白檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測，取100mg樣品加100μL Trizol,研磨后加900μLTrizol,手動(dòng)搖晃15秒，在溫室中靜置5分鐘；再加入200μL氯仿，手動(dòng)搖晃15秒，在溫室中靜置3分鐘；在4℃的環(huán)境下，將它12000轉(zhuǎn)離心15分鐘；取上清500μL，加入500μL異丙醇，手動(dòng)搖晃15秒，在溫室中靜置15分鐘；再將它12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，加入200-300μL75%冰酒精；然后再7500轉(zhuǎn)離心5分鐘，5-10分鐘的通風(fēng)櫥干燥，最后加入雙無水20μL，85℃水浴5分鐘。采用2-△△Ct方法計(jì)算出TLR4/TRIF通路蛋白中TLR4、TRIF、TRAM表達(dá)量，內(nèi)參β-actin：上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′,下游引物5′-TAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；TLR4：上游引物5′-TCCTCTCCTGCCTGAGACC-3′，下游引物5′-CATGCATTGGTAAGTAGTGTTGGA-3′；TRIF：上游引物5′-TGAGGAGGGTTTCTGGTAGC-3′，下游引物5′-GGATGCCCAGAAGAACTTGT-3′；TRAM：上游引物：5′-CTCGCCTGCTTTTGTGGT-3′，下游引物：5′-TCGTTGGTGTCATCTTCTGC-3′。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 空白組大鼠紋狀體和皮層有清晰的層。模型組大鼠炎性細(xì)胞浸潤到病變部位，一些空洞的病變被界定的膠質(zhì)瘢痕包圍，并在大腦同側(cè)(受傷)側(cè)變成囊性。給藥組大鼠在同側(cè)(損傷)腦皮質(zhì)和紋狀體未見空洞和排列不規(guī)則的細(xì)胞，見圖1。

圖1 三組大鼠病理組織學(xué)觀察圖(HE×400)Figure 1 Histopathological observation of rats in three groups

2.2 Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響 模型組、給藥組大鼠NSE、GFAP水平高于空白組，BDNF水平低于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；給藥組大鼠NSE、GFAP水平低于模型組，BDNF水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1 Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響Table 1 Effects of Rho kinase inhibitor on nerve function in rats

2.3 Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠抗炎作用的影響 模型組、給藥組大鼠TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；給藥組大鼠TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2 Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠抗炎作用的影響Table 2 Effects of Rho kinase inhibitor on anti-inflammatory effect in rats

2.4 Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠腦組織中TLR4/TRIF通路蛋白的影響 模型組、給藥組大鼠腦組織中TLR4、TRIF、TRAM蛋白表達(dá)量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；給藥組大鼠腦組織中TLR4、TRIF、TRAM蛋白表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表3。

表3 Rho激酶抑制劑對(duì)大鼠腦組織中TLR4/TRIF通路蛋白的影響Table 3 Effect of Rho kinase inhibitor on TLR4 / TRIF pathway protein in rat brain

3 討論

腦梗死屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，大多數(shù)都是由于腦部血液供應(yīng)障礙造成的。腦組織中出現(xiàn)了缺血缺氧壞死和神經(jīng)功能缺損，會(huì)引起一系列臨床癥狀和體征，比如偏癱、肢體麻木和失語等[5-6]。隨著生活水平的提升，腦梗死發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量和身心健康。受影響的大腦部位決定腦梗死的癥狀，當(dāng)梗死位于原發(fā)性運(yùn)動(dòng)皮層時(shí)會(huì)引起對(duì)側(cè)偏癱[7-8]，還會(huì)引起身體對(duì)側(cè)虛弱和失去知覺，頭部體檢表現(xiàn)為對(duì)側(cè)眼球運(yùn)動(dòng)不足和瞳孔擴(kuò)張異常等現(xiàn)象。

Rho激酶抑制劑對(duì)腦血管痙攣選擇性擴(kuò)張，可以增加腦血流量、降低血管阻力和改善腦灌注，還能通過增加肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性促使血管平滑肌舒張，改善腦組織的供血和供養(yǎng)。Rho激酶抑制劑可抑制炎性細(xì)胞、腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和炎性因子分泌及釋放，減少腦組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和組織損傷[9-10]；可促進(jìn)Ca2+濃度的恢復(fù)，保證腦組織中線粒體功能正常，促進(jìn)乳酸氧化，從而保護(hù)腦組織；可促進(jìn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸形成，對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的消失具有抑制作用；可抑制血漿中ET-1的表達(dá)，增加腦循環(huán)血量，促進(jìn)腦組織恢復(fù)[11-12]。本研究結(jié)果顯示，與模型組和空白組大鼠相比，Rho激酶抑制劑可顯著改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，清除機(jī)體炎癥反應(yīng)。

BDNF主要分布于大腦的所有皮層區(qū)以及部分皮層下和脊髓區(qū)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)生長因子，與神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)元修復(fù)相關(guān)[13]。NSE存在于神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)，是一種特殊蛋白酶，由神經(jīng)細(xì)胞分泌形成的，可作為鑒別診斷腦梗死的主要指標(biāo)[14]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的組成成分是星形膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架組成重要成分是GFAP，其水平高低與神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度相關(guān)[15]。TNF-α、ICAM-1、IL-1β等因子與大腦缺血有關(guān)，可以作用于血腦屏障破壞、髓鞘脫失、膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和白細(xì)胞浸潤[16]。大腦在接受缺血性損傷刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)炎性因子，它會(huì)誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種粘附分子，比如單核細(xì)胞黏附蛋白、血管細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞間黏附分子等[17]。臨床研究顯示[18-19]，TLR4/TRIF信號(hào)通路與多種腦血管疾病相關(guān)，其中TLR4組織分布十分廣泛，在許多組織細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，在腦組織中主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，主要分布在大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、側(cè)腦室和軟腦膜。在中樞系統(tǒng)壞死凋亡的細(xì)胞會(huì)釋放出HSP60，TLR4的神經(jīng)毒性化合物會(huì)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞合成。TLR4還可以識(shí)別表面活性劑A、纖維蛋白原肽、硫酸肝素片段、透明質(zhì)烷低聚糖和防御素[20]。TRIF是TLR下游信號(hào)通路中的重要因子，可以抵抗炎癥和抑制細(xì)胞的凋亡，為機(jī)體提供內(nèi)源性的保護(hù)作用。TRIF途徑主要通過接受內(nèi)毒素等刺激因子的刺激激活I(lǐng)RF-3，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為：TLR4→TRIF相關(guān)的接頭分子→TRIF→TRAF結(jié)合蛋白-1→IRF-3，之后經(jīng)過作用于神經(jīng)遞質(zhì)，最終導(dǎo)致神經(jīng)病變[21]。本研究結(jié)果顯示，Rho激酶抑制劑經(jīng)作用于TLR4/TRIF信號(hào)通路，抑制腦梗死患者炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)，最終起到改善腦梗死癥狀的目的。

4 結(jié)論

Rho激酶抑制劑可顯著改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能和抑制炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與TLR4/TRIF信號(hào)通路相關(guān)。