外源性硫化氫對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷的改善作用及相關(guān)機(jī)制

曾進(jìn) 田密 成建 蒙迪 聶偉

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 株洲 412000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是中風(fēng)的一種亞型，具有極高的致死率和致殘率[1]。早期腦損傷(Early brain injury，EBI)被證明是SAH患者高致死率的主要原因[2]。SAH后腦組織產(chǎn)生的氧化應(yīng)激、腦水腫、血腦屏障通透性改變以及神經(jīng)元的凋亡發(fā)生等均為EBI的重要成因[3]。硫化氫(H2S)作為繼NO和CO之后公認(rèn)的第三種氣體信號(hào)分子，其具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[4-6]。最近研究顯示，外源性硫化氫能顯著降低實(shí)驗(yàn)性SAH大鼠的腦損傷，且對(duì)癲癇大鼠的神經(jīng)元具有一定程度的保護(hù)作用，但對(duì)其作用機(jī)制的研究尚不完備[7-8]。硫氧還蛋白系統(tǒng)包括硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)、硫氧還蛋白還原酶及NADPH等，是一個(gè)有效的蛋白還原系統(tǒng)，在機(jī)體氧化還原調(diào)節(jié)、抗氧化防御以及細(xì)胞增殖和生存過程中均發(fā)揮重要的作用[9-10]。雖然已有研究顯示H2S能夠通過激活TRX系統(tǒng)發(fā)揮對(duì)損傷機(jī)體的保護(hù)作用，但在SAH誘導(dǎo)的EBI研究中尚未見報(bào)道[11]?；诖?，我們推測(cè)H2S可能通過激活TRX系統(tǒng)改善SAH誘導(dǎo)的EBI。故本研究構(gòu)建大鼠SAH模型并采用外源性H2S進(jìn)行干預(yù)，探討H2S對(duì)EBI的改善作用及機(jī)制，加深對(duì)SAH誘導(dǎo)的EBI致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為臨床治療SAH提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 36只6-7周齡無特定病原體(SPF)級(jí)健康雄性SD大鼠，體重(260±20)g，購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(湘)2015-0002。H2S供體NaHS購自Sigma公司；SOD及MDA測(cè)定試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量測(cè)定試劑盒、DAB顯色試劑盒、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人TRX1多克隆抗體、兔抗人TXNIP單克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體以及兔抗人cleaved-caspase3多克隆抗體均購自英國Abcam公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體，購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；Tanon-4100全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及SAH模型制備 實(shí)驗(yàn)開始前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物先在動(dòng)物室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食，環(huán)境濕度45%～60%，溫度(23±2)℃。1周后，將36只大鼠隨機(jī)分成3組，假手術(shù)組、模型組和H2S供體-NaHS治療組，每組12只，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間大鼠體重比較無顯著差異(P>0.05)。模型組及治療組大鼠采用改良血管內(nèi)穿刺法制作SAH模型[12]：腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉大鼠，后仰臥位將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部皮膚剪毛暴皮，常規(guī)消毒處理；采用手術(shù)刀于頸正中切開皮膚，依次分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，并結(jié)扎ECA和ICA之間的吻合支。將ECA結(jié)扎并剪斷，拉直，使其與ICA成一條直線，后將直徑為0.126 mm頭部銳化后的單股尼龍線由ECA置入ICA直至顱內(nèi)，遇阻時(shí)再往前3 mm刺破血管，造成SAH；約15 s后拔出尼龍線，結(jié)扎ECA殘端，恢復(fù)血流后縫合傷口。假手術(shù)組除不刺破血管外，其余步驟一致。造模2 h后治療組大鼠按100 μmol/kg劑量腹腔內(nèi)注射2 mL NaHS溶液，而模型組和假手術(shù)組大鼠均腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估及腦含水量檢測(cè) 每組隨機(jī)挑選6只大鼠，參照Garcia等[13]的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。總分18分，共包括6項(xiàng)：①觸須反應(yīng)。②肢體的本體感覺。③攀爬運(yùn)動(dòng)能力。④前爪的伸展性。⑤四肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性。⑥自主運(yùn)動(dòng)能力。每項(xiàng)0-3分，得分越低說明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。隨后將神經(jīng)功能評(píng)估后的各組大鼠斷頸處死，取腦組織記錄濕重A，后在100℃烤箱中烘烤24 h后取出記錄干重B，腦含水量=(腦濕重A-腦干重B)/腦濕重A×100%。

1.2.3 HE染色觀察腦組織海馬區(qū)病理變化 造模24 h后，斷頭處死各組剩余大鼠并取腦組織，剝離海馬區(qū)，并分成兩等份。一部分保存于4%多聚甲醛固定48 h，另一部分-80℃凍存?zhèn)溆?。取固定?8 h的海馬組織標(biāo)本，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作病理切片(厚度3～5 μm)。將石蠟切片依次再經(jīng)脫蠟、蘇木精染色、分化以及藍(lán)化后伊紅染色、洗滌脫水以及透明后封片。光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.4 海馬組織內(nèi)源性H2S及氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平檢測(cè) 取各組大鼠凍存的海馬組織，用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)制備組織勻漿，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，后根據(jù)各指標(biāo)試劑盒說明依次進(jìn)行操作，分光光度計(jì)下記錄各組各指標(biāo)的讀數(shù)，最后根據(jù)各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出每組樣本的各指標(biāo)的實(shí)際濃度。其中內(nèi)源性H2S含量以nmol·g-1(protein)表示，SOD含量以U·mg-1(protein)表示，MDA含量以mmol·g-1(protein)表示。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡 將各組海馬組織石蠟切片依次進(jìn)行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用PBS沖洗3次；加入50 μL轉(zhuǎn)化劑-POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μL DAB底物，于15～25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，光鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野，觀察凋亡細(xì)胞并計(jì)算凋亡率，其中陽性染色的細(xì)胞核呈棕褐色。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取-80℃凍存的海馬組織，分別進(jìn)行蛋白提取，后進(jìn)行濃度檢測(cè)；取20 μg蛋白和4 μL 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入兔抗人一抗(TRX1，1∶1000；TXNIP，1∶1000；Bcl-2，1∶1000；cleaved-caspase3，1∶1000；GAPDH，1∶1500)在4℃下孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG(1∶5000)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，后采用Quantity One圖像處理軟件對(duì)各指標(biāo)灰度值進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 外源性H2S治療改善SAH大鼠神經(jīng)功能及腦含水量 造模24 h后評(píng)估結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組和NaHS治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別為(16.5±0.89)分、(7.83±1.24)分、(12.83±1.64)分，與假手術(shù)組比較，SAH模型組大鼠評(píng)分顯著降低(P<0.05)，而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠評(píng)分顯著升高(P<0.05)，見圖1A。造模24 h后檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組和NaHS治療組大鼠腦含水量分別為(55.36±4.58)%、(82.38±3.97)%、(65.47±3.34)%，與假手術(shù)組比較，SAH模型組大鼠腦含水量顯著升高(P<0.05)，而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠鼠腦含水量顯著降低(P<0.05)，見圖1B。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量檢測(cè)Figure 1 Neurological function score and brain water content of rats in each group 注：A.神經(jīng)功能評(píng)分;B.腦含水量檢測(cè)。1.假手術(shù)組;2.SAH模型組;3.NaHS治療組。與假手術(shù)組比較，①P<0.05;與SAH模型組比較，②P<0.05

2.2 外源性H2S治療改善SAH大鼠早期腦損傷 造模24 h后海馬組織HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠腦海馬組織錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰可見，排列整齊，細(xì)胞數(shù)目多，核仁明顯，胞質(zhì)豐富；模型組大鼠腦海馬組織錐體細(xì)胞排列雜亂，基質(zhì)疏松，細(xì)胞脫失明顯，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、溶解等現(xiàn)象；而NaHS治療組大鼠海馬組織病變得到緩解，僅少量錐體細(xì)胞變性、脫失或核固縮，錐體細(xì)胞排列較整齊，核仁較清晰，見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織HE染色(400×)Figure 2 HE staining of hippocampal tissue of rats in each group 注：A.假手術(shù)組;B.SAH模型組;C.NaHS治療組

2.3 外源性H2S治療增加SAH大鼠海馬組織內(nèi)源性H2S水平、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng) 分光光度計(jì)法測(cè)定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SAH模型組大鼠海馬組織內(nèi)源性H2S、SOD水平顯著降低，而MDA水平顯著升高(均P<0.05)；而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠海馬組織內(nèi)源性H2S、SOD水平顯著升高，而MDA水平顯著降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠海馬組織內(nèi)源性H2S，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平檢測(cè)Table 1 The levels of endogenous H2S,SOD and MDA in hippocampus

2.4 外源性H2S治療抑制SAH大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡 為進(jìn)一步探究外源性H2S治療對(duì)SAH早期腦損傷大鼠的修復(fù)作用，我們采用TUNEL染色鑒定和比較各組凋亡神經(jīng)元。TUNEL染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組和NaHS治療組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率分別為(11.35±1.26)%、(37.56±3.24)%、(22.91±2.64)%，與假手術(shù)組比較，SAH模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05)；而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡Figure 3 The apoptosis of hippocampal neurons in each group of rats A.海馬組織TUNEL染色(400×);B.海馬組織神經(jīng)元凋亡率比較。1.假手術(shù)組;2.SAH模型組;3.NaHS治療組。與假手術(shù)組比較，①P<0.05;②與SAH模型組比較，P<0.05

2.5 硫氧還蛋白系統(tǒng)參與外源性H2S對(duì)SAH大鼠早期腦損傷的修復(fù) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SAH模型組大鼠海馬組織TRX1及Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)，TXNIP和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠海馬組織TRX1及Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)，TXNIP和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織TRX1、TXNIP、Bcl-2及cleaved-caspase3蛋白水平Figure 4 Trx1,TXNIP,BCL 2 and cleared caspase 3 protein levels in hippocampus of rats in each group注：A.Western blot檢測(cè)各指標(biāo)蛋白水平表達(dá);B.各指標(biāo)蛋白水平半定量分析。1.假手術(shù)組;2.SAH模型組;3.NaHS治療組。與假手術(shù)組比較，①P<0.05;與SAH模型組比較，②P<0.05

3 討論

早期腦損傷(EBI)指的是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后72 h內(nèi)所發(fā)生的整個(gè)腦組織的直接性損傷，涉及急性腦血管痙攣、神經(jīng)血管炎癥、腦血管功能障礙、血腦屏障損壞、腦積水及神經(jīng)元凋亡等[14]。近些年，研究者對(duì)EBI的關(guān)注程度逐漸上升，其病理生理過程日益清晰，多種藥物也被運(yùn)用于臨床治療，但EBI患者的治療效果仍不容樂觀[15]，這提示EBI的治療還面臨著巨大挑戰(zhàn)。

硫化氫(H2S)作為一種新型的信號(hào)分子，在血管性、神經(jīng)性、缺血再灌注等多種疾病中均發(fā)揮了重要的生理和病理作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S補(bǔ)給治療能顯著改善SAH大鼠EBI，主要體現(xiàn)在神經(jīng)功能評(píng)分的提升、腦積水含量的降低、海馬組織病理學(xué)損傷的修復(fù)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的削弱及神經(jīng)元凋亡率的降低這外源性H2S補(bǔ)給療法在SAH治療上是可行的。Cui等[7]在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，SAH發(fā)生能顯著抑制腦組織及血漿H2S的產(chǎn)生，而補(bǔ)給外源性H2S進(jìn)行治療后，大鼠EBI癥狀(包括腦水腫、血腦屏障破壞、腦細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及腦血管痙攣)得到顯著改善；且外源性H2S。氧化應(yīng)激是一種病理狀態(tài)，導(dǎo)致過度積累的氧自由基及相關(guān)代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞本身所產(chǎn)生的多種毒性作用[17]。外源性H2S對(duì)于氧化應(yīng)激性疾病的治療研究也十分廣泛，如Pan等[18]發(fā)現(xiàn)外源性H2S對(duì)于高鹽誘導(dǎo)的大鼠心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)及心肌肥大均具有較好的抑制作用。Gao等[19]發(fā)現(xiàn)外源性H2S在疊氮化鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激中扮演著極好的神經(jīng)性保護(hù)作用。而本研究同樣發(fā)現(xiàn)外源性H2S同樣能降低SAH大鼠海馬組織的氧化應(yīng)激進(jìn)而發(fā)揮對(duì)EBI的保護(hù)作用。

硫氧還蛋白(TRX)系統(tǒng)對(duì)于維持細(xì)胞的還原性微環(huán)境意義重大。哺乳動(dòng)物體內(nèi)含有兩套TRX系統(tǒng)細(xì)胞質(zhì)TRX1系統(tǒng)及線粒體TRX2系統(tǒng)，硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)則是細(xì)胞TRX的內(nèi)源性抑制劑[20]。細(xì)胞質(zhì)TRX1對(duì)機(jī)體內(nèi)氧化性蛋白具有還原性，但當(dāng)其與TXNIP結(jié)合時(shí)抗氧化能力便會(huì)大大降低造成細(xì)胞因累積氧化應(yīng)激反應(yīng)而更易發(fā)生凋亡現(xiàn)象。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通過siRNA靶向抑制TRX1的表達(dá)能進(jìn)一步促進(jìn)大鼠腦缺血再灌注后的氧化應(yīng)激損傷，提示TRX1可能受核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)控，進(jìn)而影響硫氧還蛋白過氧化物酶的還原活性。而Liang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，TXNIP在SAH大鼠損傷腦組織中的表達(dá)異常偏高；而通過白藜蘆醇(TXNIP抑制劑)進(jìn)行處理后顯著降低了TXNIP及線粒體相關(guān)促凋亡因子的水平，并降低了SAH的預(yù)后指標(biāo)，如腦積水、血腦屏障通透性及神經(jīng)功能缺陷，這提示TXNIP可作為SAH的治療靶點(diǎn)。而本研究結(jié)果顯示外源性H2S能顯著促進(jìn)SAH大鼠海馬組織TRX1，抑制TXNIP的表達(dá)，提示外源性H2S對(duì)SAH后EBI的保護(hù)作用與TRX系統(tǒng)密切相關(guān)。

線粒體依賴性凋亡途徑在正常細(xì)胞遭受非生理性改變時(shí)會(huì)被激活細(xì)胞凋亡刺激促使凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)生平衡失調(diào)，同時(shí)破壞線粒體膜致使細(xì)胞色素C(Cyt C)從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終誘導(dǎo)下游的caspase3被激活[23]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SAH大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率顯著提升，Bcl-2表達(dá)下降而cleaved-caspase3表達(dá)上升；而外源性H2S補(bǔ)給治療顯著降低了神經(jīng)元凋亡率，且上調(diào)了Bcl-2和下調(diào)了cleaved-caspase3的表達(dá)在脊髓缺血再灌注損傷的研究中，Xie等[24]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是自噬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的主要誘因，且通過外源性H2S治療能降低自噬神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，恢復(fù)損傷大鼠的神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能；這一效應(yīng)被證明與AKT-mTOR通路的調(diào)控密切相關(guān)。在慢性腎病的相關(guān)研究中，Askari等[25]發(fā)現(xiàn)長期進(jìn)行外源性H2S補(bǔ)給治療能通過改善腎臟中氧化劑/抗氧化劑的平衡，減少炎癥和細(xì)胞凋亡來預(yù)防慢性腎病。由此可見，在多種疾病損傷中，外源性H2S可通過調(diào)控凋亡信號(hào)通路發(fā)揮損傷作用。

4 結(jié)論與啟示

外源性硫化氫可改善SAH大鼠早期腦損傷，這可能與激活硫氧還蛋白系統(tǒng)，進(jìn)而降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。這一結(jié)果將為SAH的臨床治療提供新思路。