洋甘菊總黃酮成分分析及其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

米熱阿依·麥麥提 ，王 瑩，趙生俊*，蘭 衛(wèi)

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

肥胖癥是一種常見的脂質(zhì)代謝紊亂綜合征，它不僅是單純的體重增加， 而且與糖尿病、高血壓、血脂異常、癌癥等慢性病有密切關(guān)系[1-2]。肥胖正成為全球性的首要健康問題。隨著人們生活水平的提高，肥胖癥發(fā)病率逐年上升，人們對(duì)其關(guān)注度也越來越高[3]。造成肥胖的最主要原因是，飲食中攝入超過機(jī)體本身所需要的能量，如甘油三酯[4]。胰脂肪酶(pancreatic lipase,PL)是一種由動(dòng)物或人的胰腺分泌的水溶性脂肪分解酶，在甘油三酯的消化中發(fā)揮著重要作用，它可以消化食物中50%～70%的膳食脂肪[5]，是人體主要的脂肪分解酶[6]。作為脂質(zhì)吸收緩解的關(guān)鍵酶，胰脂肪酶在維持體內(nèi)脂代謝平衡中發(fā)揮著極其重要的作用。胰脂肪酶抑制劑通過抑制胰脂肪酶的活性可有效抑制膳食中脂肪的吸收，從而達(dá)到治療肥胖的目的[7]。 Orlistat是FDA批準(zhǔn)的減肥藥，于20世紀(jì)90年代后期投放市場(chǎng)，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是對(duì)抗肥胖的關(guān)鍵武器；但是，由于嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如脂肪和油性大便、惡心、嘔吐、腸胃氣脹、肝損傷等，已經(jīng)出現(xiàn)了安全問題[8]。因此，有必要找到更有效、更安全的胰脂肪酶抑制劑，作為預(yù)防和治療肥胖的替代藥物。

洋甘菊(MatricariachamomillaL.)，又稱母菊或德國(guó)洋甘菊，是菊科(Compositae)母菊屬(Matricaria)一年生草本植物[9]，甘香微苦，主產(chǎn)于我國(guó)新疆南疆地區(qū)。中藥化學(xué)成分研究表明，洋甘菊主要含有揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類、香豆素類、皂苷類等化學(xué)成分[10-11]。其中，黃酮類化合物是洋甘菊主要的藥理活性成分，主要有槲皮素、芹菜素、木犀草素、蘆丁等，具有抗菌、抗氧化、消炎、抗癌、抗心血管病等多種藥理作用[12-13]。由于洋甘菊獨(dú)特的藥理作用，其研究和應(yīng)用受到研究者的廣泛關(guān)注。蘭衛(wèi)等[14-15]研究了德國(guó)洋甘菊對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血脂癥大鼠的降脂作用以及維藥洋甘菊體外抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖作用；馬紅梅等[16]研究了洋甘菊提取物對(duì)2型糖尿病小鼠的降血糖作用及抗氧化作用；郭玉婷等[17]研究了維藥洋甘菊提取物對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用；葉琦等[18]研究了異槲皮苷等6個(gè)洋甘菊黃酮成分對(duì)DPPH自由基的清除活性；趙一帆[19]從洋甘菊中分離出39個(gè)化合物，鑒定出34個(gè)化合物，非黃酮類成分居多。因此，作者采用回流法提取洋甘菊總黃酮，經(jīng)D-101大孔吸附樹脂對(duì)粗提物進(jìn)行純化，采用液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-TOF-MS/MS)對(duì)純化的洋甘菊總黃酮進(jìn)行成分分析，以4-甲基傘形油酸酯(4-MUO)為底物，研究洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用，為洋甘菊總黃酮的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

洋甘菊藥材，采于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院藥材基地，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定，確定為母菊屬一年生草本植物德國(guó)洋甘菊(MatricariachamomillaL.)。

無(wú)水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、一水合物檸檬酸(C6H8O7·H2O)，北京酷來寶科技有限公司；甲醇(色譜級(jí))、乙腈(色譜級(jí))、二甲亞砜(色譜級(jí))、甲酸(色譜級(jí))、肉桂酸-3-苯丙酯、4-甲基傘形油酸酯(4-MUO，探針底物)、4-甲基傘形酮(4-MU)、脂肪酶，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；0.1 mol·L-1檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH值7.4)，室溫配制，保存。

SpectraMax iD3型多模式酶標(biāo)儀(SpectraMax?iD3)，奧地利Molecular Devices；振蕩恒溫金屬浴、低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific； LC-30AT型超快速液相色譜儀(UFLC)，日本Shimadzu；AB SCIEX Triple TOF 4600型三重四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex。

1.2 方法

1.2.1 洋甘菊總黃酮的提取

取洋甘菊粉末，加入12倍體積的70%乙醇提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮；用D-101大孔吸附樹脂純化，收集洗脫液，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，干燥，即得洋甘菊總黃酮，含量為56%(UV法)。

1.2.2 洋甘菊總黃酮的成分分析

洋甘菊總黃酮樣品溶液的制備：精密稱取洋甘菊總黃酮粉末15 mg，加入1 mL甲醇溶解，超聲(功率100 W，40 kHz)處理20 min，靜置冷卻至室溫，稀釋至3 mg·mL-1，置于低溫高速離心機(jī)中12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，注入到液相瓶中待測(cè)。

色譜條件：C18色譜柱(2.0 mm×250 mm,5 μm)，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量3 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)200～800 nm，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)，流速0.4 mL·min-1，洗脫梯度：0.01 min，95%A-5%B;2.0 min，95%A-5%B;30 min，55%A-45%B;45 min，5%A-95%B;50 min，95%A-5%B。

質(zhì)譜條件：檢測(cè)模式為ESI離子源(negative ion mode)，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.3 胰脂肪酶活性測(cè)定

洋甘菊總黃酮樣品溶液的配制：稱取洋甘菊總黃酮粉末，用緩沖液配成濃度分別為50 mg·mL-1、20 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、1.56 mg·mL-1、0.78 mg·mL-1的樣品溶液。

總反應(yīng)體系200 μL：2 μL不同濃度的洋甘菊總黃酮樣品溶液、2 μL 10 μg·mL-1胰脂肪酶溶液、194 μL 0.1 mol·L-1檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH值7.4)、2 μL 10 μmol·L-14-MUO溶液。首先，緩沖液、胰脂肪酶溶液和不同濃度洋甘菊總黃酮樣品溶液在生理?xiàng)l件(pH值7.4、37 ℃)下混合孵育，然后加入4-MUO溶液開始反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)產(chǎn)物4-MU的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm)。按下式計(jì)算胰脂肪酶的殘余活性(%)：

式中：F1為待測(cè)體系熒光強(qiáng)度；F2為空白體系熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Peak View軟件2.20(AB Sciex,USA)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Graph Pad Prism 7.0軟件(Graph Pad Software,Inc.,USA)對(duì)胰脂肪酶抑制實(shí)驗(yàn)的IC50值進(jìn)行非線性回歸評(píng)估。

2 結(jié)果與討論

2.1 洋甘菊總黃酮的成分分析

按1.2.2色譜和質(zhì)譜條件，對(duì)洋甘菊總黃酮樣品溶液進(jìn)行LC-TOF-MS/MS檢測(cè)，采用Peak View軟件2.20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到總離子流圖(圖1)。結(jié)合高分辨質(zhì)譜信息并參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)洋甘菊總黃酮進(jìn)行成分分析，共鑒定出38個(gè)黃酮類化合物(表2)。

圖1 洋甘菊總黃酮的LC-TOF-MS/MS總離子流圖(負(fù)離子模式)

表2 洋甘菊總黃酮的成分分析

續(xù)表2

2.2 洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

終濃度為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、100 μg·mL-1的洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用如圖2所示。

圖2 洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

由圖2可以看出，洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)洋甘菊總黃酮濃度較低(≤1 μg·mL-1)時(shí)，胰脂肪酶的殘余活性不超過50%。

為了定量分析洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用，采用不同濃度的洋甘菊總黃酮進(jìn)行胰脂肪酶抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同濃度洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

由圖3可以看出，洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶介導(dǎo)的4-MUO水解的IC50值為(1.09±0.08) μg·mL-1，表明洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶具有較強(qiáng)的抑制作用。

3 結(jié)論

采用液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-TOF-MS/MS)對(duì)純化的洋甘菊總黃酮進(jìn)行成分分析，共鑒定出38個(gè)黃酮類化合物，為洋甘菊總黃酮的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。胰脂肪酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶具有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值為(1.09±0.08) μg·mL-1，是安全有效的胰脂肪酶抑制劑，有望成為預(yù)防和治療肥胖的替代藥物。本實(shí)驗(yàn)僅研究了洋甘菊總黃酮對(duì)胰脂肪酶的體外抑制效果，體內(nèi)及藥用效果還有待于進(jìn)一步研究。