一株芘好氧降解菌的篩選鑒定及共代謝特性研究

馮清敏，王子豪，唐家璇，林軍章，譚曉明，汪衛(wèi)東，黃婷婷，田泊凝，肖 盟*

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042；2.中國石化勝利油田分公司石油工程技術(shù)研究院，山東 東營 257000)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由兩個及兩個以上苯環(huán)稠合而成的持久性有機污染物[1-2]，主要來源于石油、煤炭、木材等有機高分子化合物的不完全燃燒過程以及原油的開采過程[3]。多環(huán)芳烴具有很強的疏水性和生物毒性[4]，其在環(huán)境中的積聚嚴(yán)重危害人類的身體健康。目前，環(huán)境中的多環(huán)芳烴主要通過吸附、光降解、化學(xué)氧化、生物法等方法降解[5]，其中，生物法，尤其是微生物的礦化作用，具有成本低、綠色環(huán)保、降解效果顯著、不會殘留有毒有害中間代謝產(chǎn)物等優(yōu)點，是降解多環(huán)芳烴的主要手段。多環(huán)芳烴高效降解菌的篩選是降解多環(huán)芳烴的關(guān)鍵。目前，對于降解菌的報道大多針對低分子量多環(huán)芳烴[6]，降解機理比較清晰；而高分子量多環(huán)芳烴因其水溶性差、生物利用率低、降解難度大[7]，相關(guān)生物降解途徑不夠清晰。因此，篩選高分子量多環(huán)芳烴降解菌，并探究其降解機理及強化措施，對有效降解環(huán)境中的多環(huán)芳烴具有一定的指導(dǎo)意義。

共代謝作用是微生物降解多環(huán)芳烴的重要手段[8]。共代謝基質(zhì)主要有葡萄糖、乙酸、蛋白胨等簡單碳源以及水楊酸、鄰苯二酚等中間代謝產(chǎn)物。添加共代謝基質(zhì)后，可以顯著提高微生物的代謝性能，進(jìn)而強化其對多環(huán)芳烴的降解。然而，隨著共代謝基質(zhì)被微生物吸收殆盡，微生物對多環(huán)芳烴的共代謝作用也隨之降低，最終導(dǎo)致多環(huán)芳烴的殘留或不完全降解，產(chǎn)生有毒有害的中間代謝產(chǎn)物。對于受原油污染的環(huán)境，共代謝基質(zhì)的選擇最好是“就地取材”，從而避免因共代謝基質(zhì)消耗而影響微生物對多環(huán)芳烴的降解，即將原油中的易降解烴類(如飽和烴和芳烴)作為共代謝基質(zhì)，原位強化微生物對多環(huán)芳烴的共代謝作用。

芘作為高分子量多環(huán)芳烴模式化合物，普遍存在于石油污染土壤及油田廢水中。然而，有關(guān)微生物以石油烴為共代謝基質(zhì)降解芘的研究相對較少。因此，作者從勝利油田沾三區(qū)塊石油污染土壤中篩選一株以芘為唯一碳源和能源的降解菌，考察菌株的生長特性及其對芘的降解性能，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)分析中間代謝產(chǎn)物，推測菌株的代謝途徑；分別以飽和烴、芳烴和原油為共代謝基質(zhì)，結(jié)合降解酶活性分析，探討不同共代謝基質(zhì)對菌株共代謝性能的影響，為高分子量多環(huán)芳烴的降解提供一定的理論支持。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

原油，由中國石化勝利油田分公司石油工程技術(shù)研究院提供，其飽和烴、芳烴、非烴和瀝青質(zhì)的含量分別為48.13%、22.15%、10.04%和19.83%，四組分測定方法參照SY/T 5119-2016 《巖石中可溶有機物及原油族組分分析》。

芘(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)，Aldrich公司；酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙酸乙酯、丙酮、無水硫酸鈉、氯化鈉等均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 6890/5975型氣質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent 6460C型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，氯化鈉10.0，pH值7.0。

無機鹽培養(yǎng)基(g·L-1)：KH2PO41.0，CaCl20.01，K2HPO41.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，MgSO40.5，NH4NO31.0，pH值7.0，加入2%瓊脂粉可作為固體培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min。

芘-無機鹽培養(yǎng)基：以丙酮為溶劑，配制4 g·L-1芘儲備液；取適量儲備液于錐形瓶中，置于暗處，待丙酮完全揮發(fā)后加入適量無機鹽培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 芘降解菌的篩選

取10 g石油污染土壤加入到含有100 mg·L-1芘的芘-無機鹽培養(yǎng)基中，在35 ℃、150 r·min-1條件下，于空氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)7 d；培養(yǎng)結(jié)束后，取上層培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含有300 mg·L-1芘的芘-無機鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d；重復(fù)以上操作，依次以芘濃度500 mg·L-1和700 mg·L-1的芘-無機鹽培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接富集；富集結(jié)束后，取0.1 mL培養(yǎng)液，梯度稀釋后涂布于芘-無機鹽固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中；待長出菌落，挑取菌落大小及形態(tài)不同的單菌落并劃線分離，即得到以芘為唯一碳源的降解菌。

1.4 芘降解菌的鑒定

菌株形態(tài)觀察：將篩選菌株于LB培養(yǎng)基中活化至對數(shù)期，取適量菌細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液沖洗后，用透射電鏡觀察菌株大小及形態(tài)。

菌株種屬鑒定：提取篩選菌株的DNA，用通用引物擴增菌株的16S rDNA序列，引物序列為27F (5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；然后將擴增產(chǎn)物送至生工(上海)生物工程有限公司測序；將測序所得序列提交至NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對，用MEGA 7.0進(jìn)行序列同源性分析，依據(jù)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定芘降解菌的種屬。

1.5 芘降解菌的生長特性

最適生長溫度的測定：將活化后的菌液按5%接種量接種至含有100 mg·L-1芘的芘-無機鹽培養(yǎng)基中，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃條件下，于空氣浴振蕩器中150 r·min-1培養(yǎng)7 d，測定不同溫度下的OD600值和培養(yǎng)液中芘的含量。以上試樣均做3個平行。

最適pH值的測定：調(diào)整芘-無機鹽培養(yǎng)基的pH值分別為5、6、7、8、9，將活化后的菌液按5%接種量接種至含有100 mg·L-1芘的芘-無機鹽培養(yǎng)基中，在35 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，測定不同pH值下的OD600值和培養(yǎng)液中芘的含量。以上試樣均做3個平行。

1.6 芘降解率的測定

用等體積乙酸乙酯超聲萃取培養(yǎng)液30 min，靜置2 h后收集萃取液，重復(fù)萃取3次，合并有機相；加入無水硫酸鈉，4 ℃靜置過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)萃取液并定容至1 mL；用0.22 μm有機濾膜過濾后，采用HPLC測定芘的含量，并計算降解率。以上試樣均做3個平行。HPLC測試條件：Water C18色譜柱，紫外檢測器，柱溫35 ℃，流動相為甲醇，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長254 nm。

1.7 中間代謝產(chǎn)物分析

取降解7 d后的菌液，用等體積乙酸乙酯超聲萃取3次后，合并有機相；然后用6 mol·L-1鹽酸調(diào)整萃余液pH值為2.0，重復(fù)萃取3次，合并中性和酸性萃取液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL；有機濾膜過濾后，分別用GC-MS和HPLC-MS測定中間代謝產(chǎn)物組成。

GC-MS樣品須氮吹揮干，加入150 μL正己烷，再加入300 μL BSTFA-三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1)，60 ℃反應(yīng)45 min，最后添加正己烷定容至1 mL。GC-MS條件：HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，電子轟擊(EI)離子源；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃；全掃描模式，掃描范圍：50～550 amu；氮氣流速1 mL·min-1。程序升溫條件：初始溫度120 ℃，保持2 min；以2 ℃·min-1升溫至280 ℃，保持2 min。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

HPLC-MS條件：C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)和XEVO G2-XS Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀，采用軟電離，正負(fù)離子模式檢測；進(jìn)樣量2 μL；檢測時間6 min；流動相水-乙腈(90∶10)，梯度洗脫：10%乙腈保持0.2 min，1 min后升至99%，保持2.8 min后回到初始比例直到6 min；質(zhì)譜儀離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃。

1.8 共代謝實驗

為了探究不同共代謝基質(zhì)對降解菌共代謝性能的影響，分別以100 mg·L-1的飽和烴、芳烴、原油為共代謝基質(zhì)，以只含有100 mg·L-1芘的芘-無機鹽培養(yǎng)基為對照，接種后于35 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)30 d，并分別于7 d和30 d測定芘的降解率。

1.9 降解酶活性的測定

按1.8方法培養(yǎng)菌液。待降解至第7 d，分別測定水楊酸羥化酶、原兒茶酸-3,4-雙加氧酶、鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶和鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶的活性。粗酶液的制備參照Bradford[9]的方法；水楊酸羥化酶、原兒茶酸-3,4-雙加氧酶、鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶和鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶活性的測定分別參照Zhou等[10]、Bubinas等[11]、Xu等[12]和劉娜等[13]的方法。以上試樣均做3個平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 芘降解菌的篩選與鑒定

以芘為唯一碳源進(jìn)行芘降解菌的篩選，得到了一株能以芘為唯一碳源和能源的降解菌M4。M4的菌落在芘-無機鹽固體培養(yǎng)基上呈淺黃色，邊緣清晰(圖1a)；透射電鏡照片顯示菌株呈短棒狀，長度約1～2 μm，且有鞭毛(圖1b)。

圖1 菌株M4的菌落形態(tài)(a)及透射電鏡照片(b)

根據(jù)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。經(jīng)16S rDNA測序并與Genbank數(shù)據(jù)庫比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株M4與假單胞菌(Pseudomonas)HL22-2的同源性最高，序列相似度為99.41%，推斷菌株M4為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)，命名為Pseudomonassp.M4。

圖2 基于菌株M4 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 芘降解菌的生長特性

在不同溫度和不同pH值下，菌株M4的芘降解率和OD600值如圖3所示。

圖3 不同溫度(a)和不同pH值(b)下，菌株M4的芘降解率及OD600值

由圖3可知，隨著溫度的升高和pH值的增大，芘降解率及菌體濃度(OD600值)均先升高后降低。當(dāng)溫度為35 ℃時，芘降解率及菌體濃度均達(dá)到最高，表明菌株M4的最適生長溫度為35 ℃；當(dāng)pH值為7時，芘降解率最高，且具有最高的菌體濃度，表明菌株M4的最適pH值為7。

2.3 中間代謝產(chǎn)物分析

通過GC-MS和HPLC-MS分析菌株M4降解芘的中間代謝產(chǎn)物。根據(jù)中間代謝產(chǎn)物的GC-MS總離子流圖(圖4)，共檢測到6種中間代謝產(chǎn)物，各代謝產(chǎn)物的碎片離子質(zhì)荷比(m/z)及結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖4 菌株M4降解芘的中間代謝產(chǎn)物的GC-MS總離子流圖及GC-MS檢測到的中間代謝產(chǎn)物

微生物對芘的降解通常存在兩種代謝途徑：水楊酸途徑和鄰苯二甲酸途徑[14]。由圖4可知，降解過程中產(chǎn)生了下游代謝產(chǎn)物苯甲酸、鄰苯二酚、鄰苯二甲酸單烯丙酯[15]，推測菌株M4對芘的降解過程存在鄰苯二甲酸途徑。然而，鄰苯二甲酸和水楊酸在GC-MS中均未被檢出。為了確定是否存在鄰苯二甲酸和水楊酸，配制水楊酸、鄰苯二甲酸、鄰苯二酚和1-羥基-2-萘甲酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用HPLC-MS在負(fù)離子模式下對標(biāo)準(zhǔn)樣品和降解樣品作進(jìn)一步檢測，結(jié)果見表1。

表1 HPLC-MS檢測到的中間代謝產(chǎn)物

由表1可知，在降解樣品中檢測到了4種中間代謝產(chǎn)物，保留時間分別為0.510 min、0.621 min、2.250 min和3.701 min，[M-H]的質(zhì)荷比分別為165.019 7、137.024 9、208.052 5和232.052 5，分別對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鄰苯二甲酸、水楊酸、3,4-二羥基菲和4,5-二羥基芘。

綜合GC-MS和HPLC-MS的分析結(jié)果，菌株M4降解芘的中間代謝產(chǎn)物包括上游代謝產(chǎn)物1-羥基芘、4,5-二羥基芘、3,4-二羥基菲和1,2-二羥基萘，以及苯甲酸、鄰苯二酚、鄰苯二甲酸單烯丙酯、鄰苯二甲酸、水楊酸等下游代謝產(chǎn)物。

芘的生物降解過程中，遵循從高環(huán)數(shù)向低環(huán)數(shù)轉(zhuǎn)化的規(guī)律[16]，首先在雙加氧酶的作用下發(fā)生羥基化反應(yīng)，生成4,5-二羥基芘，再通過加氧酶、脫氫酶等轉(zhuǎn)化為3,4-二羥基菲，從而進(jìn)入菲的代謝途徑[17]。在菲的降解過程中，會產(chǎn)生標(biāo)志性代謝產(chǎn)物1-羥基-2-萘甲酸。但本實驗并未檢測到1-羥基-2-萘甲酸，可能該物質(zhì)含量很低，產(chǎn)生后被快速消耗。許多芳烴雙加氧酶基因的研究可以支持這一推測[18-19]。1-羥基-2-萘甲酸的降解存在兩種代謝途徑[20]，分別為水楊酸途徑和鄰苯二甲酸途徑[21]。1-羥基-2-萘甲酸在還原酶的作用下生成1,2-二羥基萘，本實驗代謝產(chǎn)物中存在水楊酸、1,2-二羥基萘和鄰苯二酚，表明菌株M4對芘的降解存在水楊酸途徑。此外，1-羥基-2-萘甲酸可在雙加氧酶、脫氫酶和脫氫異構(gòu)酶的作用下，轉(zhuǎn)化為順式-2′-羧基苯丙酮酸鹽，進(jìn)一步生成鄰苯二甲酸。根據(jù)GC-MS的分析結(jié)果，存在鄰苯二甲酸單烯丙酯，該物質(zhì)為鄰苯二甲酸的衍生物，而HPLC-MS分析中檢測到了鄰苯二甲酸，表明在芘降解過程中，也存在鄰苯二甲酸途徑。因此，根據(jù)文獻(xiàn)報道的代謝途徑，結(jié)合GC-MS和HPLC-MS分析結(jié)果，推斷菌株M4對芘的降解同時存在水楊酸途徑和鄰苯二甲酸途徑，如圖5所示。

圖5 菌株M4對芘的代謝途徑(括號內(nèi)的物質(zhì)為已檢測到的中間代謝產(chǎn)物)

2.4 不同共代謝基質(zhì)對降解菌共代謝性能的影響

分別以飽和烴、芳烴和原油為共代謝基質(zhì)，以只含有芘的芘-無機鹽培養(yǎng)基作為對照，分別測定7 d和30 d的芘降解率，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同共代謝基質(zhì)對芘降解率的影響

由圖6可知，添加共代謝基質(zhì)均能夠促進(jìn)芘的降解，其中添加原油的效果最為明顯；7 d芘降解率由高到低依次為原油組、飽和烴組、芳烴組和對照組，降解率分別為26.56%、21.50%、18.20%和17.01%，而30 d芘降解率普遍高于7 d降解率，由高到低依次為原油組、飽和烴組、芳烴組和對照組，降解率分別為61.23%、55.76%、44.71%和42.05%。表明，隨著時間的延長，芘降解率逐漸升高。相較于芳烴，飽和烴更容易被微生物降解利用[22]，以飽和烴為共代謝基質(zhì)能夠顯著提高微生物的代謝活性[23]，使得芘降解率顯著高于對照組和芳烴組。據(jù)文獻(xiàn)報道，在Acinetobacterjohnsonii同步降解萘和芘的過程中，萘可被優(yōu)先降解，同時降解菌的生物量和降解酶活性均顯著提高，進(jìn)而促進(jìn)芘的降解[24]。由此推斷，以芳烴為共代謝基質(zhì)時，低分子量的芳烴也能夠提高相關(guān)降解酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)芘的降解。但芳烴與芘的降解可能存在競爭性抑制[25]，因而其降解率低于飽和烴組。當(dāng)以原油為共代謝基質(zhì)時，由于飽和烴和芳烴共存，因此，既能提高微生物的代謝性能，又能提高降解酶的活性，因此，以原油為共代謝基質(zhì)時的芘降解率最高。在實際環(huán)境中，飽和烴和芳烴并不可能單獨存在，以原油作為共代謝基質(zhì)能有效模擬實際環(huán)境，且不需要添加其它外源營養(yǎng)物質(zhì)，實現(xiàn)了共代謝基質(zhì)的“就地取材”，避免了因外源營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡而引起降解菌降解性能的下降。

2.5 降解酶活性分析

為了探究菌株M4利用石油烴的共代謝機理，明確菌株M4降解芘的主要途徑，對降解過程中水楊酸羥化酶、原兒茶酸-3,4-雙加氧酶、鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶和鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶的活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖7所示。

a.水楊酸羥化酶 b.原兒茶酸-3,4-雙加氧酶 c.鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶 d.鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶

由圖7可知，不同共代謝基質(zhì)可以強化不同種類的降解酶活性。以原油為共代謝基質(zhì)時，水楊酸羥化酶的活性顯著升高(圖7a)，僅添加飽和烴對水楊酸羥化酶無明顯誘導(dǎo)作用，因此，推斷原油能夠顯著提高水楊酸羥化酶的活性。然而，飽和烴顯著提高了原兒茶酸-3,4-雙加氧酶的活性(圖7b)，添加芳烴次之，而后是原油組和對照組，表明以原油為共代謝基質(zhì)不能強化原兒茶酸-3,4-雙加氧酶的活性。鄰苯二酚是水楊酸的下游代謝產(chǎn)物，鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶和鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶是鄰苯二酚降解的關(guān)鍵酶，經(jīng)鄰苯二酚雙加氧酶催化后便可進(jìn)入TCA循環(huán)。添加原油后鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶的活性偏低(圖7c)，鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶的活性較高(圖7d)，可見當(dāng)以原油為共代謝基質(zhì)時，鄰苯二酚的降解主要依賴于鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶。綜合降解酶活性分析，以原油為共代謝基質(zhì)會顯著提高水楊酸羥化酶和鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶的活性，即主要通過提高水楊酸途徑中降解酶的活性強化菌株M4對芘的共代謝作用。

3 結(jié)論

從石油污染土壤中篩選到一株能以芘為唯一碳源和能源的降解菌，命名為Pseudomonassp.M4。菌株M4降解芘的最適生長溫度為35 ℃、最適pH值為7。通過GC-MS和HPLC-MS分析，推斷菌株M4對芘的降解存在水楊酸途徑和鄰苯二甲酸途徑。共代謝實驗結(jié)果表明，相較于飽和烴和芳烴，以原油為共代謝基質(zhì)時芘的降解率最高，30 d降解率達(dá)61.23%。降解酶活性分析表明，不同的共代謝基質(zhì)會強化不同代謝途徑中的酶活性。以原油為共代謝基質(zhì)時，菌株M4主要通過強化水楊酸途徑中降解酶的活性實現(xiàn)對芘的共代謝作用。因此，綜合生長條件及共代謝性能，菌株M4對原油污染的環(huán)境有較好的適應(yīng)性，不需要添加外源營養(yǎng)物，能夠有效利用原油強化高分子量多環(huán)芳烴的降解，具有較好的應(yīng)用前景。