滑膜組織中MMP-13與β-catenin對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的評(píng)估價(jià)值

朱志勇，吳開(kāi)元，汪海軍，袁永端，張 偉，朱 凡

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種退行性骨關(guān)節(jié)病，主要特點(diǎn)為骨贅形成、關(guān)節(jié)軟骨破壞[1]，在中老年人中患病率較高。研究表明，在我國(guó)年齡超過(guò)40歲的群體中，OA患病率高達(dá)28.7%，其中女性32.8%，男性23.5%[2]。OA發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，主要與年齡、創(chuàng)傷、遺傳、過(guò)度負(fù)重、肥胖等因素存在關(guān)聯(lián)[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)屬于MMPs家族的重要成員，參與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分解、代謝過(guò)程，并且能對(duì)Ⅱ型膠原進(jìn)行水解，導(dǎo)致軟骨發(fā)生磨損病變[4]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin信號(hào)通路對(duì)軟骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡有調(diào)節(jié)作用，且對(duì)軟骨基質(zhì)分解、代謝存在較大影響[5]。由此可見(jiàn)，MMP-13、β-catenin可能與OA發(fā)病有關(guān)。本研究旨在分析滑膜組織中MMP-13、β-catenin在OA嚴(yán)重程度中的評(píng)估價(jià)值，為臨床診療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取我院2017-04至2019-04收治的OA患者92例，根據(jù)疾病嚴(yán)重程度將其分成輕度組(n=47)、中/重度組(n=45)。輕度組男25例，女22例，年齡38～76歲，平均(58.91±9.71)歲；體質(zhì)指數(shù)(18～24) kg/m2，平均(21.08±1.25)kg/m2；病程3～13個(gè)月，平均(8.63±3.25)月。中/重度組男22例，女23例，年齡35～78歲，平均(59.24±8.82)歲；體質(zhì)指數(shù)(18～24)kg/m2，平均(21.14±1.16)kg/m2；病程3～12個(gè)月，平均(8.26±3.11)月。本研究方案獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組基線(xiàn)資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)[6]制定的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)》中關(guān)于OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)X線(xiàn)、CT等檢查結(jié)合臨床表現(xiàn)證實(shí)；(2)關(guān)節(jié)液黏稠、清亮；(3)晨僵時(shí)間≤30 min；(4)活動(dòng)時(shí)存在骨擦感；(5)患者簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)惡性腫瘤；(2)入院前有骨關(guān)節(jié)手術(shù)史；(3)入院前3個(gè)月內(nèi)有抗炎治療史；(4)未能獲得滑膜組織標(biāo)本。

1.3 方法 利用免疫組化法測(cè)定所有患者滑膜組織中MMP-13、β-catenin的陽(yáng)性、陰性表達(dá)情況。患者入院后行關(guān)節(jié)置換術(shù)，并取滑膜組織送檢。經(jīng)多聚甲醛溶液(濃度為4%)固定24 h，然后行免疫組化檢測(cè)。

1.3.1 HE染色 (1)取材固定，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm；(2)脫蠟至水；(3)經(jīng)蘇木精進(jìn)行復(fù)染，時(shí)間為5 min，經(jīng)自來(lái)水予以沖洗；(4)采用鹽酸乙醇分化，時(shí)間為30 s；(5)經(jīng)50 ℃溫水浸泡5 min；(6)置于伊紅液內(nèi)反應(yīng)2 min；(7)脫水、透明，經(jīng)中性樹(shù)脂封片。

1.3.2 免疫組化染色 (1)石蠟切片，在60 ℃環(huán)境下烘烤1 h；(2)脫蠟至水；(3)浸泡于過(guò)氧化氫(3 g/L)內(nèi)，經(jīng)蒸餾水進(jìn)行3次水洗；(4)經(jīng)復(fù)合消化液予以處理，時(shí)間為5 min，經(jīng)蒸餾水進(jìn)行3次水洗；(5)羊正常血清封閉20 min，將多余液體去除，無(wú)需清洗；(6)加入一抗，在4 ℃環(huán)境下孵育18 h，經(jīng)PBS緩沖液進(jìn)行3次沖洗，2 min/次；(7)經(jīng)生物素化羊抗兔IgG進(jìn)行孵育，時(shí)間為20 min，經(jīng)PBS緩沖液進(jìn)行3次沖洗，2 min/次；(8)經(jīng)鏈卵白素工作液(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)孵育20 min，經(jīng)PBS緩沖液進(jìn)行4次沖洗，5 min/次；(9)行DAB染色，流水即可終止；(10)經(jīng)蘇木精進(jìn)行復(fù)染，脫水、透明，經(jīng)中性樹(shù)膠予以封片。

1.3.3 采用反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)法測(cè)定MMP-13、β-catenin在滑膜組織中的表達(dá)量 (1)將提前凍存的組織標(biāo)本取出，剪碎后置于Trizol(1ml)內(nèi)，充分均漿；(2)以1 ml∶200 μl比例將氯仿溶液加入Trizol內(nèi)，充分混勻，在室溫下反應(yīng)5 min；(3)在4 ℃條件下離心15 min(13000 r/min)；(4)取冰異丙醇加入上清液，在-20 ℃冰箱內(nèi)反應(yīng)1 h，在4 ℃條件下離心10 min(13000 r/min)，棄上清液，使RNA于管底沉淀；(5)取乙醇(濃度為75%)1 ml對(duì)RNA沉淀進(jìn)行清洗，振蕩并懸浮沉淀；(6)在4 ℃條件下離心5 min(7500 r/min)，棄上清液，經(jīng)移液器將殘留上清液吸除，在室溫下反應(yīng)5～10 min；(7)取去離子水20 μl加入，將RNA溶解；(8)將部分RNA稀釋?zhuān)瑢?duì)其濃度、純度予以計(jì)算，存放于-80 ℃冰箱內(nèi)。經(jīng)GeneRunner軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。繪制受試者工作特征曲線(xiàn)(ROC)分析MMP-13、β-catenin表達(dá)量對(duì)OA嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) (1)陰性、陽(yáng)性判定：取10個(gè)高倍鏡視野(×400)進(jìn)行觀察，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～25%為弱陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)50%為強(qiáng)陽(yáng)性。(2)OA嚴(yán)重度評(píng)估：參考《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)》[6]評(píng)估，無(wú)異常為0級(jí)；關(guān)節(jié)內(nèi)有可疑骨贅，關(guān)節(jié)間隙未見(jiàn)異常為Ⅰ級(jí)；關(guān)節(jié)內(nèi)肯定有骨贅形成，且關(guān)節(jié)間隙疑似狹窄為Ⅱ級(jí)；關(guān)節(jié)內(nèi)存在少量骨贅，伴囊性、硬化病變，關(guān)節(jié)間隙狹窄為Ⅲ級(jí)；關(guān)節(jié)內(nèi)存在多發(fā)骨贅形成，伴囊性、硬化病變，關(guān)節(jié)間隙消失或重度狹窄為Ⅳ級(jí)。其中Ⅰ級(jí)屬于輕度病變，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)為中/重度病變。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-13、β-catenin的陽(yáng)性表達(dá)比較 輕度組的MMP-13、β-catenin陽(yáng)性率分別為68.09%(32/47)、55.32%(26/47)，顯著低于中/重度組的88.89%(40/45)、75.56%(34/45)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.848，P=0.016；χ2=4.150，P=0.042)。

2.2 MMP-13、β-catenin的表達(dá)量比較 輕度組MMP-13(0.69±0.24)、β-catenin(0.95±0.37)的表達(dá)量均低于中/重度組(1.02±0.31，2.16±1.12)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.724，P<0.001；t=7.019，P<0.001)。

2.3 MMP-13、β-catenin表達(dá)量對(duì)OA嚴(yán)重度的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 MMP-13、β-catenin表達(dá)量預(yù)測(cè)OA嚴(yán)重度的曲線(xiàn)下面積分別為0.656、0.683。以MMP-13>0.887、β-catenin>1.975時(shí)，病情發(fā)展為中/重度的風(fēng)險(xiǎn)越高(表1)。ROC曲線(xiàn)見(jiàn)圖1、2。

表1 MMP-13、β-catenin表達(dá)量對(duì)OA嚴(yán)重度的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

圖1 MMP-13表達(dá)量預(yù)測(cè)OA嚴(yán)重度的ROC曲線(xiàn)

圖2 β-catenin表達(dá)量預(yù)測(cè)OA嚴(yán)重度的ROC曲線(xiàn)

3 討 論

OA具有癥狀反復(fù)、病程長(zhǎng)等特點(diǎn)，這類(lèi)患者通常需長(zhǎng)期接受治療，且要對(duì)其病情進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，提高治療針對(duì)性。現(xiàn)階段，各類(lèi)檢查方法均不適用于OA的動(dòng)態(tài)觀察，導(dǎo)致患者病情難以及時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，影響治療方案的制定。本研究針對(duì)OA患者進(jìn)行MMP-13與β-catenin檢測(cè)，分析二者在滑膜組織中的變化情況，便于評(píng)價(jià)患者的疾病嚴(yán)重度。

本研究結(jié)果提示，輕度組的MMP-13、β-catenin陽(yáng)性率顯著低于中/重度組，且二者陰性率高于中/重度組，表明隨著OA病情越重，患者的MMP-13、β-catenin陽(yáng)性率越高，陰性率越低。有研究指出MMPs等蛋白酶可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞，從而引起OA病變[7]。MMPs可對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解，并將其他MMPs激活，產(chǎn)生瀑布效應(yīng)，促進(jìn)OA進(jìn)展[8]。MMPs含5類(lèi)酶系，其中明膠酶、基質(zhì)降解素、膠原酶是3類(lèi)比較重要的酶系，而最早發(fā)現(xiàn)的酶系為膠原酶，包括MMP-13、MMP-8及MMP-1，以MMP-13最具活性[9]。研究表明MMP-13可將IX型膠原降解，而IX型膠原對(duì)維持軟骨穩(wěn)定性而言至關(guān)重要，一旦其被降解，則會(huì)削弱軟骨穩(wěn)定性，從而引起軟骨損害，這可能是MMP-13引起OA病變的重要機(jī)制[10]。β-catenin已被證實(shí)能調(diào)節(jié)人體骨骼、軟骨發(fā)育，其信號(hào)通路在成年人中呈低表達(dá)[11]。而OA病變可激活β-catenin信號(hào)通路，從而對(duì)軟骨細(xì)胞分化、成熟有促進(jìn)作用，可使蛋白酶活性增強(qiáng)[12]。因此，β-catenin信號(hào)通路異常會(huì)加重OA病變程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，輕度組MMP-13、β-catenin的表達(dá)量均低于中/重度組，且經(jīng)ROC曲線(xiàn)證實(shí)二者對(duì)OA嚴(yán)重度具有預(yù)測(cè)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，在OA患者的軟骨降解過(guò)程中有炎性反應(yīng)參與，如腫瘤壞死因子α、IL-1β等均參與了這一過(guò)程，且這些因子能使OA軟骨內(nèi)MMPs表達(dá)上調(diào)[13]。這為本研究提供了理論支持，本研究主要針對(duì)MMP-13進(jìn)行探討，它是軟骨基質(zhì)降解過(guò)程中的主要蛋白酶，可體現(xiàn)Ⅱ型膠原代謝情況。研究表明IL-6參與了MMPs對(duì)機(jī)體的調(diào)控過(guò)程，它結(jié)合于自身可溶性受體后，能使軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)退變，但具體機(jī)制尚未明確[14]。因此，筆者推測(cè)隨著OA越嚴(yán)重，患者的炎性反應(yīng)越重，IL-6水平越高，從而進(jìn)一步對(duì)軟骨細(xì)胞中MMP-13表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，導(dǎo)致其上調(diào)。β-catenin信號(hào)在正常機(jī)體中對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，可促進(jìn)其成熟，然而，一旦其表達(dá)過(guò)度，則會(huì)導(dǎo)致成熟加速，并上調(diào)蛋白酶表達(dá)量，促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解，致關(guān)節(jié)軟骨破損[15]。這表明β-catenin信號(hào)過(guò)表達(dá)會(huì)為軟骨基質(zhì)降解提供條件，加重OA病情進(jìn)展。

總之，OA患者病情越重，MMP-13與β-catenin陽(yáng)性率越高，且二者在滑膜組織中的表達(dá)量越高，MMP-13、β-catenin在滑膜組織中的表達(dá)量對(duì)OA嚴(yán)重度具有預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究選取92例，樣本量少，未來(lái)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討。