DABS-Cl柱前衍生HPLC測(cè)定發(fā)芽糙米粉中γ-氨基丁酸

杜金鳳，郭航宏，陶曉杰，張念潔，宋鑒達(dá)

延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所（延吉 133000）

糙米是稻谷脫殼后不加工或者較少加工所獲得的全谷米粒，富含豐富的膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)，由米糠、胚、和胚乳三大部分組成，是一種功能性食品[1]。糙米在一定的工藝條件下萌發(fā)生芽，經(jīng)加工干燥后會(huì)得到具有活性的發(fā)芽糙米，糙米在發(fā)芽過(guò)程中會(huì)激活并釋放蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等生物活性成分，能催化蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素等功能物質(zhì)的富集和轉(zhuǎn)化。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，稻谷發(fā)芽會(huì)激活稻米中的谷氨酸脫氫酶，谷氨酸脫羧酶水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)形成的谷氨酸中含有大量的γ-氨基丁酸[2-3]。

γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌等各種生物體內(nèi)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，γ-氨基丁酸（GABA）具有降三壓、緩解心率[4-6]、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、預(yù)防老年癡呆、抗腫瘤、排毒、增強(qiáng)免疫力等功效[7-9]，具有很高的保健價(jià)值和醫(yī)用價(jià)值。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于發(fā)芽糙米粉中γ-氨基丁酸含量的測(cè)定方法主要有比色法[10]、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氨基酸分析儀法[11-13]等。其中比色法、薄層色譜法操作簡(jiǎn)單，成本較低，但發(fā)芽糙米粉樣品成分復(fù)雜，含有多種游離氨基酸，能與顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，比色時(shí)容易產(chǎn)生干擾，影響測(cè)定結(jié)果，毛細(xì)管電泳法實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程復(fù)雜、氨基酸自動(dòng)分析法的分析儀器價(jià)格比較昂貴，限制其使用。高效液相色譜儀具有測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。由于γ-氨基丁酸本身對(duì)紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能被用紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外常采用的衍生試劑有2, 4-二硝基氟苯（FDNB）、鄰苯二甲醛（OPA）-巰基乙醇、異硫氰酸苯酯（PITC）等[14-17]，但存在反應(yīng)條件苛刻、樣品前處理復(fù)雜、衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、試劑毒性大等缺點(diǎn)[18-19]。試驗(yàn)采用4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）[20]為衍生試劑柱前衍生，通過(guò)HPLC測(cè)定發(fā)芽糙米粉中的γ-氨基丁酸含量，旨在建立準(zhǔn)確高效的發(fā)芽糙米粉中γ-氨基丁酸定量分析方法，為發(fā)芽糙米粉中的γ-氨基丁酸的含量分析和質(zhì)控提供理論技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；無(wú)水乙醇（優(yōu)級(jí)純（色譜純，國(guó)藥化學(xué)集團(tuán)有限公司）；4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl，美國(guó)AAT Bioquest公司）。試驗(yàn)用水（色譜純，德國(guó)CNW Technologies公司）。發(fā)芽糙米粉樣品（本單位送檢樣品）。

Aglient-1260型高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器；C18反相柱；TD6M低速離心機(jī)（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；精密天平（奧豪斯儀器有限公司）；QL-901旋渦振蕩器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ-600DV超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；FZl02微型植物試樣粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 溶液的配制

4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）衍生溶液：稱取20.0 mg 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯粉末，用乙腈溶解并稀釋至10 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，現(xiàn)用現(xiàn)配。

碳酸氫鈉溶液：稱取0.40 g碳酸氫鈉，用水溶解并稀釋至10 mL，過(guò)0.22 μm水相濾膜，現(xiàn)用現(xiàn)配。

50 mmol/L三水合乙酸鈉溶液：稱取6.80 g三水合乙酸鈉，用水溶解并稀釋至1 L，過(guò)0.22 μm水相濾膜，備用。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取0.01 g（精確至0.000 1 g）γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液a，于-18 ℃貯存在棕色瓶中保存，備用。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取a液，用乙腈逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為20，40，60，80和100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待測(cè)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

將發(fā)芽糙米樣品混勻，縮分至約50 g，用粉碎機(jī)充分粉碎后全部過(guò)0.250 mm直徑篩，均質(zhì)，裝入密閉容器中，室溫保存，備用。

1.3.1γ-氨基丁酸提取

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 80%的乙醇溶液，旋渦振蕩2 min，在50 ℃下超聲提取30 min，靜置5 min后，于4 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，樣品殘?jiān)儆?0 mL 80%乙醇溶液按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，最后用80%乙醇溶液定容，搖勻，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，待衍生化。

1.3.2 衍生化試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1 mL試樣溶液、1 mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、1 mL 80%乙醇溶液于10 mL具塞試管中，分別加入0.2 mL碳酸氫鈉溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋渦混勻，在70 ℃水浴中衍生反應(yīng)20 min，冷卻至室溫，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：三水合乙酸鈉溶液-乙腈=65∶35（V/V）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)438 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生產(chǎn)物在210～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)全掃描，所得吸收光譜如圖1所示。衍生產(chǎn)物在438 nm處有最大吸收峰，且此處干擾峰較少，故選擇438 nm為作為γ-氨基丁酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 γ-氨基丁酸的全波長(zhǎng)掃描吸收光譜

2.2 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜法測(cè)定γ-氨基丁酸常用磷酸鹽緩沖溶液-甲醇或者乙酸鈉溶液-乙腈為流動(dòng)相，研究表明，磷酸鹽緩沖溶液-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，需要梯度洗脫，洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，且基線不穩(wěn)，采用乙酸鈉溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，洗脫時(shí)間縮短，且基線穩(wěn)定，分離度高。試驗(yàn)選用Aglient-C18反相色譜柱對(duì)γ-氨基丁酸進(jìn)行分離，以50 mmol/L三水合乙酸鈉溶液-乙腈（65∶35，V/V）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，所得的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)芽糙米粉樣品、衍生化試劑DABS-Cl的液相色譜圖如圖2所示。發(fā)芽糙米粉中γ-氨基丁酸的保留時(shí)間為4.637 min，與γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間4.641 min基本保持一致，衍生試劑DABS-Cl的保留時(shí)間為3.255 min，基線穩(wěn)定，對(duì)被測(cè)物質(zhì)色譜峰無(wú)干擾，分離度高無(wú)拖尾，峰型左右對(duì)稱，樣品分離時(shí)間短，表明該條件下γ-氨基丁酸的分離效果較好。

圖2 不同樣品的色譜圖

2.3 柱前衍生化條件的優(yōu)化

2.3.1 衍生時(shí)間的影響

設(shè)定衍生化反應(yīng)溫度70 ℃，考察不同衍生時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品衍生物峰面積的影響。取1 mL 40 μg/mL的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，準(zhǔn)確加入0.2 mL碳酸氫鈉溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋渦混勻，在70 ℃水浴中分別反應(yīng)5，15，20，25，30，35和40 min，冷卻至室溫，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，每種條件平行試驗(yàn)3次，根據(jù)色譜條件測(cè)定，衍生時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)衍生反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，進(jìn)樣后檢測(cè)的峰面積最大，隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性降低，峰面積減小，故選擇20 min為衍生反應(yīng)的時(shí)間。

圖3 衍生時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的影響

2.3.2 衍生溫度的影響

設(shè)定衍生化反應(yīng)時(shí)間20 min，考察不同衍生溫度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品衍生物峰面積的影響。按2.3.1小節(jié)，取1 mL 40 μg/mL的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，準(zhǔn)確加入0.2 mL碳酸氫鈉溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋渦混勻，分別在60，65，70，75，80和85 ℃水浴中衍生反應(yīng)20 min，冷卻至室溫，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，每種條件平行試驗(yàn)3次，根據(jù)色譜條件測(cè)定，衍生溫度對(duì)γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)衍生溫度為70 ℃時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品衍生物峰面積最大，且峰面積趨于穩(wěn)定，隨著反應(yīng)溫度升高到80 ℃，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性降低，峰面積急劇減小，故選擇70 ℃作為衍生溫度。

圖4 衍生溫度對(duì)γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的影響

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察及檢出限

將1.2.5小節(jié)所配制的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.3.2小節(jié)的衍生化試驗(yàn)條件反應(yīng)，根據(jù)色譜條件測(cè)定，以γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，衍生后產(chǎn)物響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。γ-氨基丁酸在20～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程Y=4.318 8X+9.956 2，R2為0.999 6。以3倍的信噪比（S/N=3）計(jì)算方法的最低檢出限（LOD），結(jié)果為0.1 mg/kg；以10倍的信噪比（S/N=10）計(jì)算方法的定量限（LOQ），結(jié)果為0.4 mg/kg。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，能滿足發(fā)芽糙米粉中γ-氨基丁酸的日常檢測(cè)、定量和質(zhì)量控制要求。

圖5 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取10 μL衍生后的20 μg/mLγ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。連續(xù)測(cè)定6次的標(biāo)準(zhǔn)品峰面積分別為91.14，92.00，91.93，91.64，90.11和91.93，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為0.80%，表明該方法儀器精密度良好，準(zhǔn)確度高。

取發(fā)芽糙米粉樣品，按照樣品前處理方法同時(shí)制備6份平行樣品溶液測(cè)定，以樣品中γ-氨基丁酸峰面積考察試驗(yàn)重復(fù)性。結(jié)果顯示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為0.36%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

精密吸取10 μL衍生后的20 μg/mLγ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于0，2，4，6，8，10和24 h進(jìn)樣，測(cè)定γ-氨基丁酸峰面積。結(jié)果顯示，γ-氨基丁酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為1.08%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定，具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白基質(zhì)精白米進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度平行試驗(yàn)6次，按1.3小節(jié)的樣品前處理方法制備樣品溶液，并根據(jù)色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，在3個(gè)加標(biāo)水平下，γ-氨基丁酸的回收率為95.80%，97.39%和97.14%，平均回收率為96.78%，回收率良好，表明該方法下測(cè)得的樣品γ-氨基丁酸含量準(zhǔn)確可靠。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用該方法對(duì)單位送檢的5批次發(fā)芽糙米粉樣品進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品平行取2份，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。所檢測(cè)的5批次發(fā)芽糙米粉的γ-氨基丁酸含量分別163.25，158.74，59.23，62.78和209.85 mg/kg。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了DABS-Cl柱前衍生HPLC測(cè)定發(fā)芽糙米粉中活性成分γ-氨基丁酸含量的分析方法，采用超聲提取，DABS-Cl柱前衍生化，生成的衍生產(chǎn)物在24 h內(nèi)穩(wěn)定，分離度高。該方法前處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、無(wú)基質(zhì)干擾、檢測(cè)成本低，適用于發(fā)芽糙米粉中γ-氨基丁酸的測(cè)定。