響應(yīng)面法優(yōu)化鹿筋膠原蛋白酶解工藝及其氨基酸含量

郅慧，楊小倩，張輝，李晶峰

長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院（長春 130117）

鹿筋是梅花鹿（Cervus nipport Temminck）的四肢干燥筋，具有補(bǔ)腎陽、壯筋骨的功效，營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值極高，可應(yīng)用于食品、健康保健品等領(lǐng)域[1-3]。鹿筋中含有氨基酸、肽類、膠原蛋白、維生素、微量元素等多種生理活性物質(zhì)，其中膠原蛋白含量豐富，含量達(dá)80%以上，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗衰老等作用[4]。孫曉迪等[5]研究發(fā)現(xiàn)鹿筋酶溶性膠原可抑制大鼠足腫脹度及細(xì)胞炎癥因子的釋放，具有一定的抗炎作用。曲毅等[6]研究發(fā)現(xiàn)鹿筋膠原蛋白能有效地抑制小鼠耳廓腫脹，具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用。張鶴等[7]研究發(fā)現(xiàn)酶解后的鹿筋膠原蛋白更易被皮膚滲透吸收，具有良好的保濕、抗衰老功效。因此，鹿筋功能性食品的制備與開發(fā)受到廣泛關(guān)注，優(yōu)化鹿筋膠原蛋白制備工藝研究具有現(xiàn)實(shí)意義。

常見的膠原蛋白提取方法有酸提法、堿提法、酶提法3種。酸提法、堿提法過程難控制、反應(yīng)劇烈、影響生物活性。酶解法反應(yīng)溫和，水解速率快，無污染，過程相對安全[8]，酶解肽更易被人體吸收，其營養(yǎng)價(jià)值及生理功能可顯著提高。如何高效地提取鹿筋中的膠原蛋白、提高鹿筋的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值，成為科研界待解決的問題，而采用響應(yīng)面法優(yōu)化鹿筋膠原蛋白酶解工藝的研究鮮有報(bào)道。

因此，以梅花鹿鹿筋為原料，響應(yīng)面法優(yōu)化鹿筋膠原蛋白的酶解工藝，并對其進(jìn)行氨基酸分析，為工業(yè)制備鹿筋膠原蛋白及其開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅花鹿鹿筋（吉林省東鰲鹿業(yè)科技開發(fā)有限公司）；堿性蛋白酶（上海寶曼生物科技有限公司）；茚三酮（上海三愛思試劑有限公司）；其他試劑（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)（德國耶拿分析儀器股份有限公司）；冷凍干燥機(jī)（德國CHRIST凍干機(jī)有限公司）；L-8900型氨基酸自動分析儀（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 鹿筋前處理

稱取5.0 g鹿筋，按料液比1∶20（g/mL）溶于水中，于80 ℃磁力攪拌4 h后[9]，以3 600 r/min離心20 min，取上清液，微濾，冷凍干燥，即得鹿筋膠原蛋白粗品。

1.3.2 鹿筋膠原蛋白酶解工藝

稱取一定量的鹿筋膠原粗品，加入到一定量的水，超聲溶解，于100 ℃水浴加熱15 min，待溫度降至酶解所需溫度時(shí)，置于恒溫磁力攪拌器中攪拌，調(diào)節(jié)酶解溫度及pH，加入酶水解，水解后轉(zhuǎn)入沸水中煮沸15 min，滅酶，冷卻至室溫，以3 600 r/min離心20 min，上清液微濾，凍干，備用，即得鹿筋酶解膠原蛋白凍干樣品。

1.3.3 水解度的測定

按照茚三酮比色法測定水解度，根據(jù)式（1）計(jì)算膠原蛋白的水解度（DH）[10]。

式中：mA為供試品（樣液）溶液中膠原蛋白質(zhì)量，mg；m為稱樣質(zhì)量，mg；V1為水解液總體積，mL；V2為顯色時(shí)所用稀釋液體積，mL。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)選用堿性蛋白酶，以水解度為指標(biāo)，考察酶用量、酶解溫度、時(shí)間和pH對鹿筋膠原蛋白酶解的影響[11]。酶解單因素試驗(yàn)的基本條件為酶用量1%、溫度50 ℃、pH 9、時(shí)間6 h，改變其中的1個(gè)條件，分別考察酶用量（0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%）、酶解溫度（45，50，55，60和65 ℃）、時(shí)間（3，4，5，6和7 h）和pH（8.0，8.5，9.0，9.5和10.0）對酶解效果的影響，測定水解度，試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解溫度、pH、酶解時(shí)間3個(gè)因素為優(yōu)化對象，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

1.3.6 氨基酸組成測定

將10 mg酶解后的鹿筋膠原蛋白凍干粉加入到10 mL濃度6 mol/L鹽酸溶液中，于110 ℃水解24 h，使用氨基酸自動檢測儀測定氨基酸組成[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用Design Expert 10對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度對鹿筋膠原蛋白水解度的影響

由圖1可知，酶解溫度55 ℃時(shí)，鹿筋膠原蛋白水解度達(dá)到30.83%，為最高值。隨著酶解溫度升高，鹿筋膠原蛋白水解度先升高后降低，這是由于隨著溫度升高，活化分子有效碰撞增加，酶解效率增加，酶解溫度達(dá)到一定程度時(shí)，高溫會破壞酶的分子構(gòu)象，使酶的活性降低甚至喪失，酶解效率也逐漸降低，因此確定酶解溫度50～60 ℃為宜。

圖1 酶解溫度對水解度的影響

2.1.2 酶解時(shí)間對鹿筋膠原蛋白的影響

由圖2可知，酶解時(shí)間3～5 h范圍內(nèi)，鹿筋膠原蛋白的水解度隨時(shí)間延長而升高，但酶解時(shí)間5～7 h范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間延長水解度變化不明顯，有微弱的下降。這是由于酶解時(shí)間超過一定范圍后，酶的活性不再隨著時(shí)間延長而增加，膠原蛋白的水解度幾乎無變化，為節(jié)約時(shí)間，故選擇5 h為最佳酶解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對水解度的影響

2.1.3 pH對鹿筋膠原蛋白水解度的影響

由圖3可知，在pH 9時(shí)，鹿筋膠原蛋白水解度達(dá)到最高值27.09%。pH 7.0～11.0范圍內(nèi)，隨著pH升高，鹿筋膠原蛋白水解度先升高后降低。這是由于pH變化會影響酶活性位點(diǎn)的解離，進(jìn)而影響酶與底物蛋白的結(jié)合，使酶的活性發(fā)生改變，pH過高或過低均會使酶遭受到不可逆的破壞，故確定酶解最適pH范圍8.5～9.5。

圖3 pH對水解度的影響

2.1.4 酶底比對鹿筋膠原蛋白的影響

由圖4可知，酶底比0.4%～1.0%范圍內(nèi)，鹿筋膠原蛋白水解度隨酶底比增加而增加，酶底比超過1%時(shí)，隨著酶用量增加，水解度逐漸降低，底物達(dá)到飽和，此情況下，即使增加酶濃度，酶促反應(yīng)速率不會繼續(xù)增大，為節(jié)約成本，選擇鹿筋膠原蛋白最適酶底比1%。

圖4 不同酶底比對水解度的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素為酶解溫度（A）、pH（B）、酶解時(shí)間（C），以水解度為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化鹿筋膠原蛋白酶解工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，ANOVA方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

利用Design Expert 10軟件對自變量A、B、C進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=29.07+1.16A+0.83B+0.59C-0.22AB+0.77AC+1.90BC-2.85A2-1.54B2-2.40C2。

從方差分析結(jié)果可知（見表3），模型回歸項(xiàng)p＜0.001，說明模型顯著；失擬項(xiàng)p=0.548 5＞0.05，不顯著，表明運(yùn)用該方程預(yù)測鹿筋膠原蛋白酶解工藝可行；根據(jù)F值大小可知，3個(gè)因素對鹿筋膠原蛋白酶解效果的影響順序依次為pH（A）＞酶解溫度（B）＞酶解時(shí)間（C）；對表中的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)進(jìn)行方差分析，B、C、AC達(dá)到顯著水平（p＜0.05），A、BC、A2、B2、C2均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）；模型的決定系數(shù)R2=0.976 1，表明由響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)所獲得的回歸方程與實(shí)際情況擬合較好；變異系數(shù)（CV）為2.35%，說明試驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

各因素的響應(yīng)曲面圖可直觀地反映各因素及其交互作用對膠原蛋白水解度大小的影響程度，其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱[13-14]。根據(jù)多元回歸模型所作的響應(yīng)曲面圖和等高線如圖5～圖7所示。

酶解pH和酶解時(shí)間的響應(yīng)面曲面走勢最陡峭，表明BC的交互作用對水解度影響最大。如圖5所示，酶解時(shí)間固定時(shí)，隨著pH增大，水解度先升高后降低，說明鹿筋膠原蛋白水解度4～6 h范圍內(nèi)存在最高值，等高線呈橢圓形，表明因素BC之間交互作用顯著；如圖6所示，在酶解溫度50～60 ℃、酶解時(shí)間4～6 h范圍內(nèi)，鹿筋膠原蛋白水解度存在最佳響應(yīng)值，隨著酶解溫度及酶解時(shí)間的增加，水解度先升高后降低，等高線呈橢圓形，表明因素AC之間交互作用顯著；如圖7所示，隨著pH增加及酶解溫度升高，水解度先升高后降低，說明在所選區(qū)域內(nèi)鹿筋膠原蛋白水解度存在極值，但因素AB之間交互作用不明顯。

圖5 pH與時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 溫度與時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖7 溫度與pH交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

采用Design Expert 10軟件進(jìn)行分析，求得最優(yōu)酶解條件：pH 9.42、酶解時(shí)間5.11 h、酶解溫度53.29℃。水解度預(yù)測值為31.52%。為便于試驗(yàn)，對該條件進(jìn)行修正：pH 9.4、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度53 ℃。進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，平均值為31.07%，與預(yù)測結(jié)果相近，進(jìn)一步驗(yàn)證該條件為鹿筋膠原蛋白酶解的最優(yōu)工藝條件。

史亞萍等[15]采用復(fù)合酶酶解海參蛋白，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝后，測得水解度為21.38%。呂遠(yuǎn)奇等[16]采用木瓜蛋白酶酶解馬鹿鹿茸蛋白，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝后，測得水解度為9.7%。采用堿性蛋白酶酶解鹿筋膠原蛋白，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后測得水解度為31.07%，經(jīng)對比后發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解效果更好，為工業(yè)化大規(guī)模制備鹿筋膠原蛋白提供參考。

2.3 鹿筋膠原蛋白的氨基酸分析

膠原蛋白不同于普通的蛋白質(zhì)，其氨基酸的種類和含量與其他蛋白質(zhì)相比存在顯著差異。甘氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸在膠原蛋白的氨基酸組成中含量豐富，其中甘氨酸含量最高，約占氨基酸總含量的1/3，每隔2個(gè)其他氨基酸就有1個(gè)甘氨酸，其肽鏈可用(Gly-X-Y)n表示，脯氨酸，羥脯氨酸含量約占氨基酸總含量的15%～20%，羥脯氨酸作為膠原蛋白的特征氨基酸，含量較高，這是大多數(shù)蛋白質(zhì)所不具有的，且膠原蛋白中芳香族氨基酸和半胱氨酸含量少。

從表4可以看出，甘氨酸含量在鹿筋膠原蛋白氨基酸總含量中占比最高，約31.78%，同時(shí)脯氨酸、羥脯氨酸含量也較高，分別占氨基酸總含量的8.24%和6.05%。酪氨酸和苯丙氨酸含量為1.87%和1.79%，這與膠原蛋白氨基酸組成中亞氨基酸含量高，芳香族氨基酸和含硫氨基酸含量低的特點(diǎn)相一致。Liu等[17]研究鯰魚皮膠原蛋白時(shí)，甘氨酸含量最高，羥脯氨酸和脯氨酸含量為17%，與鹿筋相比略有差異。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道鹿筋膠原蛋白具有良好的抗炎作用，由于鹿筋的氨基酸組成中亞氨基酸含有較多，故鹿筋具有補(bǔ)腎陽、壯筋骨的功效，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)具有預(yù)防和治療的作用，由此推測亞氨基酸含量的高低與鹿筋膠原蛋白的抗炎效果有一定關(guān)系。

表4 鹿筋酶解膠原蛋白的氨基酸組成及含量

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)優(yōu)化得到鹿筋膠原蛋白最佳酶解工藝：pH 9.4、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度53 ℃。在此條件下，水解度達(dá)到31.07%。對鹿筋膠原蛋白進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果表明，鹿筋膠原蛋白氨基酸組成中甘氨酸含量最高，占總含量的30.25%，脯氨酸和羥脯氨酸含量也較高，分別占總含量的8.24%和6.05%，是典型的I型膠原蛋白。