一種藻藍蛋白衍生物的制備及穩(wěn)定性

鄭守晶，楊夢琴，鄭明鋒

1.福建農(nóng)林大學金山學院（福州 350002）；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院（福州 350002）

藻藍蛋白（phycocyanin，PC），其熒光發(fā)射峰為615～640 nm[1-2]，是一種天然無毒的色素蛋白復合體，也是我國GB 2760—2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中規(guī)定的僅有的兩種天然藍色素之一[3]，其生理功能豐富[4]，被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品中[5]。藻藍蛋白通過硫鏈鍵結(jié)合四吡咯化合物、脫輔蛋白和α、β兩個亞基[6]。1個四吡咯環(huán)輔基以共價鍵形式結(jié)合在肽鏈上[7]。三聚體和六聚體是藻藍蛋白亞基的主要存在形式，少數(shù)有二聚體或聚集度更高的聚集體。藻藍蛋白的存在形式受到離子強度、蛋白質(zhì)濃度、pH、輻射、光照強度和光照時間等因素的影響[8]。藻藍蛋白中的四吡咯類色素與葉綠素、血紅素中的四吡咯類色素的主要結(jié)構(gòu)區(qū)別在于：葉綠素卟啉環(huán)中含有一個鎂原子，血紅素卟啉環(huán)中含有一個鐵原子，而藻藍蛋白卟啉環(huán)中有一個鎳原子[9]。

目前關(guān)于藻藍蛋白衍生物的研究較少，以鈣離子替代卟啉環(huán)中心原子鎳，獲得藻藍蛋白衍生物，并研究其穩(wěn)定性，使其功效進一步擴大，既可以作為食品添加劑應(yīng)用于食品中，還能作為功能性成分應(yīng)用于生物醫(yī)藥方面，具有極大的開發(fā)潛力。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

藻藍蛋白（西安澤邦生物科技有限公司）；CaCO3、HCl、NaOH 、H2O2等均為分析純。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

UV-5500紫外-可見分光光度計（上海亞研電子公司）；W201恒溫水浴鍋（上海賢德實驗儀器公司）；L550臺式離心機（上海賢德實驗儀器公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 藻藍蛋白衍生物制備

配制100 mL 1%藻藍蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，于50 ℃水浴浸提1.0 h，離心（3 000 r/min）10 min取上清液，測定其在300～700 nm范圍內(nèi)的吸光度，繪制光譜掃描曲線。

1.3.2 藻藍蛋白衍生物的提取單因素試驗

在制備藻藍蛋白衍生物的過程中發(fā)現(xiàn)，浸提液中很少含有最大吸收峰區(qū)的干擾物質(zhì)，因此試驗采用吸光度A579的大小來衡量衍生物中色素含量的多少。

1) 溫度：配制100 mL 1%藻藍蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，分別在不同溫度（30，40，50，60和70 ℃）條件下水浴浸提1.0 h，然后3 000 r/min離心10 min，取藍色上清液[10]，再分別測定藻藍蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

2) 提取時間：配制100 mL 1%藻藍蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，于50 ℃水浴，分別浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h，然后3 000 r/min離心10 min，取藍色上清液，再分別測定藻藍蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

3) 料液比：CaCO3以1∶80，1∶90，1∶100，1∶110和1∶120（g/mL）的料液比在50 ℃水浴浸提2.5 h，然后3 000 r/min離心10 min，取藍色上清液，再分別測定藻藍蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

1.3.3 藻藍蛋白衍生物單因素正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）和料液比（C）為因素，以吸光度A579為指標，設(shè)計正交試驗，因素水平表見表1。

表1 藻藍蛋白衍生物提取試驗因素水平表

1.3.4 藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性影響

采用最佳提取工藝制備衍生物提取液，并避光冷藏于4 ℃條件下備用，參考張巖等[11]、曹竑等[12]的方法，考察溫度（40，50，60和70 ℃）、光照（室內(nèi)自然光下儲藏1，2，3和4 d）、pH（NaOH調(diào)節(jié)pH為4～10）、氧化劑（H2O2濃度分別為1%，2%，3%，4%和5%）以及常用食品添加劑（分別添加1%，2%，3%，4%和5%的葡萄糖、蔗糖和檸檬酸）這些因素對衍生物提取液穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍蛋白及衍生物的紫外-可見光吸收光譜

在300～700 nm波長范圍內(nèi)，分別用紫外-可見分光光度計對藻藍蛋白水溶液和衍生物溶液進行掃描，結(jié)果分別如圖1（a）和圖1（b）所示。由圖1（a）可知，藻藍蛋白水溶液光譜最大吸收峰為620 nm左右，與李建宏等[13]的研究一致；而圖1（b），其可見光范圍內(nèi)最大吸收峰在579 nm。對比圖1（a）和圖1（b）可知，最大吸收峰產(chǎn)生了位移。藻藍素發(fā)色基團是影響藻藍蛋白的吸收光譜主要因素，藻藍蛋白衍生物在波長579 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，說明藻藍蛋白發(fā)色基團的光譜學特性發(fā)生改變，可推斷產(chǎn)生了與天然藻藍蛋白不同的衍生物質(zhì)[14]。

圖1 藻藍蛋白溶液及衍生物溶液光譜掃描曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)溫度對藻藍蛋白衍生物的影響

由圖2（a）可知，藻藍蛋白衍生物溶液的吸光度，隨著溫度的升高，先增加后降低；當反應(yīng)溫度為50 ℃時，溶液的吸光度最高?？赡苁且驗楫敎囟瘸^藻藍蛋白穩(wěn)定溫度后，由于蛋白質(zhì)的熱變性作用導致其空間構(gòu)象的改變，從而改變發(fā)色基團的結(jié)構(gòu)[15]，導致吸光度的下降，因此反應(yīng)溫度選擇50 ℃。

由圖2（b）可知，當反應(yīng)時間小于2.5 h時，衍生物溶液的吸光度變化不明顯，可能是反應(yīng)不夠充分。當反應(yīng)時間達到3.0 h時，吸光度最高；之后又呈現(xiàn)出下降趨勢，因此反應(yīng)時間確定為3.0 h。

由圖2（c）可知，當料液比為1∶100（g/mL），藻藍蛋白與CaCO3充分接觸反應(yīng)，吸光度最大。料液比繼續(xù)增加，吸光度減小，所以料液比選擇1∶100（g/mL）。

圖2 單因素對藻藍蛋白衍生物吸光度的影響

2.3 藻藍蛋白衍生物正交試驗結(jié)果

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，安排L9(34)正交試驗，對試驗數(shù)據(jù)進行極差分析和方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 正交設(shè)計方差分析結(jié)果

由表2可知，影響衍生物溶液吸光度的主次因素為反應(yīng)溫度＞料液比＞反應(yīng)時間，其最優(yōu)組合為A2B3C1，即反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時間為3.0 h、料液比為1∶80（g/mL）。由表3可知，可知反應(yīng)溫度對吸光度有顯著影響，反應(yīng)時間和料液比對吸光度無顯著影響，與極差分析結(jié)果一致。對該反應(yīng)條件進行驗證，測得其吸光度為0.330，略優(yōu)于正交試驗中的組合。

2.4 各因素對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.1 溫度對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

溫度會對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。由圖3可知，當溫度為40 ℃時，隨著加熱時間的延長，藻藍蛋白衍生物的吸光度基本保持不變。當溫度升高到60 ℃時，衍生物的熱穩(wěn)定性降低，故吸光度呈明顯下降趨勢。另外在試驗中發(fā)現(xiàn)，當溫度達到70 ℃時，只需加熱0.5 h，溶液就變?yōu)榈仙?。因此，衍生物溶液儲存溫度不高?0 ℃，熱穩(wěn)定性較好。

圖3 溫度對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.2 光照對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，藻藍蛋白衍生物溶液光照4 d，在黑暗條件下吸光度基本保持穩(wěn)定；在自然光照射條件下，藻藍蛋白衍生物吸光度變化較大，說明光照對藻藍蛋白衍生物有一定的影響，在使用時應(yīng)避光保存。

圖4 光照對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.3 pH對藻藍蛋白衍生物的影響

pH會對蛋白質(zhì)的解離程度及所帶電荷性質(zhì)產(chǎn)生影響。由表4可知，藻藍蛋白衍生物吸光度隨著pH增加，溶液顏色由深變淺至無色。pH在5～7范圍內(nèi)，顏色穩(wěn)定，吸光度變化較小；pH在8～10范圍內(nèi)吸光度減小，溶液褪色；pH為7時吸光度最大，故儲存條件應(yīng)為近中性，其穩(wěn)定性最好。

表4 pH對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.4 氧化劑對藻藍蛋白衍生物的影響

由圖5可知，隨著氧化劑H2O2濃度的增大，吸光度呈下降趨勢，且藻藍蛋白衍生物溶液顏色由藍紫色褪色成無色，說明藻藍蛋白衍生物對抗氧化性較差，在使用時應(yīng)盡量避免與氧化性物質(zhì)接觸。

圖5 H2O2對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.5 常用添加劑對藻藍蛋白衍生物的影響

葡萄糖、蔗糖、檸檬酸是食品加工中常用的添加劑。由圖6可以看出，隨著葡萄糖和蔗糖濃度的增加，衍生物的吸光度得到提高，這可能是因為葡萄糖、蔗糖的加入起到了護色效果[16]。蔗糖雖然也能起到護色效果，但不如葡萄糖顯著。隨著檸檬酸濃度的增加，衍生物產(chǎn)生沉淀，導致吸光度降低。因此在使用過程中，應(yīng)避免和檸檬酸同用。

圖6 食品添加劑對藻藍蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

以藻藍蛋白為原料，制備其衍生物，并進行衍生物穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明：碳酸鈣與藻藍蛋白反應(yīng)后的藻藍蛋白衍生物溶液呈藍紫色，在可見光范圍內(nèi)最大吸收波長為579 nm。衍生物最佳的反應(yīng)條件是反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間3.0 h、料液比1∶100（g/mL）。該衍生物儲存溫度應(yīng)不高于40 ℃，在近中性、避光條件保存。在食品加工中，葡萄糖和蔗糖可對其產(chǎn)生增色效果，應(yīng)盡量避免與氧化性物質(zhì)、檸檬酸共同使用。

對藻藍蛋白衍生物的制備進行了初步研究，后續(xù)可對衍生物中藻藍素的提取等方面開展進一步研究，為其應(yīng)用提供更多參考價值。