零乳糖牛乳中糠醛類化合物含量變化

扶曉菲

1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院（上海 200436）；2.食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心（無錫 214122）

乳糖是乳及乳制品中常見的二糖，部分亞洲人群對乳糖顯示出不耐受的情況，無法飲用含有乳糖的乳及乳制品。乳糖不耐受癥（lactose intolerance，LI）是中國嬰幼兒的常見疾病之一，由腸道乳糖酶的相對或完全缺乏導致，嚴重時甚至會引起骨質(zhì)疏松，影響嬰幼兒發(fā)育[1]。尋找零乳糖乳制品等替代產(chǎn)品，攝入外源性乳糖酶、益生菌等常被認為是LI的3種典型治療手段[2]。零乳糖牛奶、奶酪、黃油等乳糖含量更低，同時富含更多葡萄糖、半乳糖以及轉(zhuǎn)化得到的低聚半乳糖，能為LI人群提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進身體健康并增強運動耐力[3-4]。其中，零乳糖牛奶通常需要經(jīng)巴氏殺菌，冷卻，加乳糖酶水解，再經(jīng)巴氏殺菌或超高溫滅菌，最后再經(jīng)冷卻和包裝得到，常見加工方式有三種，分別是常溫、低溫、無菌乳糖酶解[5]。

乳糖經(jīng)水解所得的半乳糖和葡萄糖，均為醛糖，具有還原性，水解反應方程式如圖1所示。同時研究指出，在乳制品熱處理過程中，還原糖經(jīng)加熱自身發(fā)生異構(gòu)化反應或與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應生成的糠醛類化合物，是加熱程度和儲藏變化的衡量指標之一[6]?？啡╊惢衔锸敲览路磻闹匾a(chǎn)物，研究最多的主要有4種，分別是5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）、2-糠醛（2-furfural，F(xiàn)）、甲基糠醛（5-methylfurfural，MF）及2-呋喃甲基酮（2-furamethylketone，F(xiàn)MC），相關(guān)報道多集中在前兩種物質(zhì)[7-8]。歐盟食品安全委員會指出HMF的攝入上限為1.6 mg/d，過量攝入則可能在人體內(nèi)積蓄，損害內(nèi)臟，具有潛在毒性[9]。

圖1 乳糖水解反應方程式

HMF形成動力學的研究報道，在3種單糖模擬體系和糖-酶解液模型體系中，HMF的積累量與反應時間和反應溫度均呈現(xiàn)正相關(guān)[10-11]。其次，Chávez-Servin等[12]的報道表示，純配方奶喂養(yǎng)的半歲左右嬰兒每日HMF攝入量約為0.63～3.25 mg，所以具有超過推薦攝入上限值的可能性。因此推測零乳糖乳及乳制品由于富含半乳糖和葡萄糖兩類還原糖，貯存過程可能更易生成糠醛類化合物，過度攝入對人體不利，因而有必要探究貨架期內(nèi)各類零乳糖產(chǎn)品中糠醛類化合物的含量變化情況。

試驗首先研究了巴氏殺菌奶中添加乳糖酶后糠醛類化合物等物質(zhì)的含量變化；進而對比了市售3大類液態(tài)乳中糠醛類化合物的含量；最后探究了在常溫和60 ℃兩種條件下UHT零乳糖液態(tài)乳中糠醛類化合物隨貯藏時間的含量變化。研究有利于了解零乳糖液態(tài)乳中糠醛類化合物的含量分布情況及變化趨勢，為零乳糖產(chǎn)品的安全貯藏、市場應用拓展作出理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草酸二水合物（純度99.5%～102.5%），上海安譜實驗科技有限公司；三氯乙酸（純度≥99.0%），國藥集團化學試劑有限公司；糠醛標準品，5-羥甲基糠醛（純度98%，CAS號：67-47-0）、2-糠醛（純度99.5%，CAS號：98-01-1）、5-甲基糠醛（純度99.6%，CAS號：620-02-0），德國Dr.Ehrenstorfer公司；2-呋喃甲基酮（純度95.5%，CAS號：1192-62-7）；乙腈、甲醇均為色譜純，德國默克股份兩合公司；乳糖酶（5 200 NLU/g），丹麥Chr-Hansen，Horsholm公司。

1.2 儀器與設備

AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；PL2002電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Milli-Q超純水機，默克化工技術(shù)（上海）有限公司；ICH1102恒溫培養(yǎng)箱，美墨爾特有限公司；SK5210HP超聲清洗儀，上?？茖С晝x器有限公司；DK-8B電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；WNB45恒溫水浴鍋，美墨爾特有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Beckman Avanti J-30I落地式離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜分析條件

選用填料粒徑為3 μm的反相C18色譜柱，色譜柱：Waters Atlantis T3（3.0 mm×15 cm，3 μm）；流動相：流動相A為水，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0～10.0 min，5% B～95% B，10.0～12.0 min，95%B～95% B，12.0～12.1 min，95% B～5% B，12.1～20.0 min，5% B～5% B；流速 0.6 mL/min；色譜柱溫度：30℃；進樣量：5 μL；進樣盤溫度：4 ℃；紫外檢測器波長：280 nm。

1.3.2 樣品的前處理

用分析天平稱取15 g液態(tài)奶樣品，加入5 mL 0.15 mol/L的現(xiàn)配草酸，于100 ℃水浴加熱25 min后，取出冷卻至室溫；再加入3 mL質(zhì)量濃度40 g/mL三氯乙酸溶液A，振蕩10 min后再離心15 min；取上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，濾渣加入5 mL 4 g/mL三氯乙酸溶液B，振蕩10 min后，離心15 min；合并上清液，加入5 mL 4 g/mL三氯乙酸溶液B定容至刻度；取1 mL液體過0.22 μm尼龍濾膜，進液相色譜儀分析。

1.3.3 乳糖酶酶解試驗

依據(jù)已有試驗數(shù)據(jù)，由于生奶與巴氏殺菌奶中糠醛類化合物含量十分接近，且考慮實際實驗室的操作的可行性，選用巴氏殺菌奶乳替代生奶來開展試驗[13]。糖酶酶解試驗，目的在于以巴氏殺菌奶為研究對象，探究了乳糖酶添加及保溫酶解時間對糠醛類化合物的影響，其中重點考察還原性雙糖體系（乳糖）與還原性單糖體系（葡萄糖和半乳糖）對糠醛類化合物生成的影響。

某品牌巴氏殺菌奶，購于上海某超市；將巴氏殺菌奶分裝至各玻璃瓶，其中對照組奶樣中乳糖酶添加量為1.5 g/kg，室溫放置；試驗組巴氏殺菌奶樣奶樣中乳糖酶添加量為1.5 g/kg，置于40 ℃的水浴鍋中加熱保溫。自0 min時刻起，依次間隔20，40，60，80，100和120 min各取出奶樣，參照GB 23780.8—2009，檢測乳糖、葡萄糖、半乳糖，同時檢測糠醛類化合物的含量。

1.3.4 市售奶樣對比試驗

市售奶樣對比試驗，選取了巴氏滅菌零乳糖、UHT滅菌乳、UHT零乳糖3大類液態(tài)乳進行試驗，目的在于比較巴氏殺菌和超高壓滅菌兩種熱處理工藝，以及常規(guī)乳制品和零乳糖液態(tài)乳中糠醛類化合物的含量，初步了解了各類市售乳品的糠醛含量差異，進一步驗證不同工藝和不同糖體系造成的糠醛生成的差異，以期為乳制品的選擇提供試驗依據(jù)。

某品牌巴氏殺菌乳A1，購于上海某超市；某品牌巴氏殺菌零乳糖調(diào)制乳B1，購于上海某超市；京東超市購買市售UHT滅菌乳C1、C2、C3共計3種；京東超市購買市售UHT零乳糖調(diào)制乳D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7共計7種；檢測并對比其中所含糠醛類化合物的量。

1.3.5 加速保存試驗

加速保存試驗指的是在特定條件下進行，用于衡量評估短期時間內(nèi)零乳糖液態(tài)乳質(zhì)量影響的試驗，通常選擇偏離產(chǎn)品標簽推薦的貯存條件來進行試驗設計，從而達到初步預測UHT零乳糖滅菌乳穩(wěn)定性的目的，并為設置長期試驗條件、優(yōu)化加工工藝等提供依據(jù)及支持性信息，進而為零乳糖液態(tài)乳的運輸、貯存提供理論指導。

某品牌UHT零乳糖滅菌乳，即1.3.4中的D3樣品，購于京東超市；將零乳糖奶分別置于室溫避光條件（推薦儲存條件25±2 ℃）與60 ℃的恒溫箱中，放置30 d。分別于0，5，10，20和30 d取樣，試驗設計見表1，檢測糠醛類化合物的含量。

表1 加速保存試驗設計

2 結(jié)果與分析

2.1 乳糖酶和酶解方式的影響

經(jīng)不同加熱酶解時間處理的巴氏殺菌奶中的乳糖、葡萄糖、半乳糖的含量變化如圖2所示。依據(jù)試驗數(shù)據(jù)可知，空白組至0 min為乳糖酶酶解時間，0～120 min為酶解保溫時間。由于奶樣中乳糖酶添加量為1.5 g/kg，酶量相對充足，乳糖酶添加后，乳糖迅速被徹底分解為葡萄糖、半乳糖，0 min時刻含量便降低至不可檢測。對比不加酶的空白點數(shù)據(jù)，乳糖含量迅速從初始值4.1 μg/100 g奶降至0 min時刻的不可檢測，反之葡萄糖和半乳糖含量均從不可檢測升至0 min時刻的2.1 μg/100 g奶和2.2 μg/100 g奶，隨后二者含量均基本保持穩(wěn)定，再無明顯變化。

圖2 糖類含量隨酶解時間的變化

乳糖酶對巴氏殺菌奶中HMF、F含量的影響如圖3所示。結(jié)合圖2可知，乳糖酶反應迅速，0 min時刻便反應完畢，乳糖酶在充分水解乳糖為葡萄糖和半乳糖的同時造成了HMF含量的迅速上升，即還原性單糖體系相比還原性雙糖體系，對HMF的影響在加熱條件下的影響最為明顯。具體表現(xiàn)：對比不添加乳糖酶的空白奶樣，在不加熱酶解條件下，HMF含量迅速由1.63 μg/100 g劇增至0 min時刻的30.51 μg/100 g，含量升高近5倍；而在40 ℃加熱酶解條件下，HMF含量迅速由1.60 μg/100 g劇增至0 min時刻的31.1 μg/100 g，含量升高近5倍；而F含量均無明顯變化。

酶解保溫，即圖3中0～120 min時刻，目的在于確保牛乳中的乳糖充分水解，但對HMF與F含量的影響有限。HMF在乳糖酶充分水解的0 min時刻已達到較大值，不加熱酶解組中HMF自0 min時刻起在29.93～37.57 μg/100 g范圍內(nèi)波動；加熱酶解組中HMF自0 min時刻起在30.27～38.70 μg/100 g范圍內(nèi)波動；而第120分鐘的F含量與第0分鐘相比均無顯著變化。

圖3 糠醛類化合物含量隨酶解時間的變化

2.2 不同加工工藝的影響

加工工藝對巴氏殺菌奶中HMF與F含量的影響如圖4所示。李文[14]采用HPLC法對比研究各類UHT滅菌奶中HMF的含量時證實，UHT零乳糖奶中的HMF含量遠遠高于UHT滅菌奶（135 ℃，15 s），約為后者的10倍。Ferrer等[15]報道指出，富含乳糖及半乳糖的UHT滅菌奶中HMF含量范圍在22.65～66.44 μg/100 g，試驗中C組中HMF的含量范圍在36.97～41.87 μg/100 g，與既有報道相符，且與B組中HMF含量接近。

圖4 各類液態(tài)乳中糠醛含量分布情況

零乳糖奶是含有葡萄糖和半乳糖的單糖體系，相比含有乳糖的普通奶組成的雙糖體系更有利于糠醛類化合物生成。對比巴氏殺菌奶組與巴氏殺菌零乳糖組，即A組和B組，熱加工工藝均為巴氏殺菌，HMF含量差異明顯，F(xiàn)含量變化不明顯。B組的HMF含量與A組的HMF相差約5倍；B組的F含量與A組相差不顯著。對比UHT滅菌奶組與UHT零乳糖組，即C組和D組，熱加工工藝均為超高壓滅菌，但HMF含量差異明顯，F(xiàn)含量相對差異不明顯。D組的HMF含量與C組相差近10倍，而F含量相差不明顯；上述結(jié)果與酶解試驗中結(jié)果一致，單糖體系更有利于糠醛類化合物生成。

UHT的熱加工強度較高，進一步加劇了HMF和F的生成。對比巴氏殺菌零乳糖奶組與UHT零乳糖組，即由B組和D組數(shù)據(jù)可知，在同樣的單糖體系中，D組HMF含量范圍在190.27～496.67 μg/100 g，而B組中的HMF含量僅為33.73 μg/100 g，相差顯著；同樣F含量范圍在4.61～5.79 μg/100 g，而B組中的F含量為2.16 μg/100 g，有一定差異。相比巴氏殺菌工藝，UHT超高溫滅菌由于滅菌溫度更高，更有利于美拉德反應的進行，導致HMF和F生成量更高。

2.3 加速保存條件

李宇棟[16]通過探究4 ℃和37 ℃兩種條件下儲存時間為56 d的UHT滅菌奶中HMF含量變化規(guī)律，結(jié)果顯示在第28天，4 ℃條件下儲存的UHT滅菌奶中HMF沒有顯著性變化，而37 ℃條件下的HMF含量則由第0天的1 000 μg/100 g上升至約1 200 μg/100 g。

高溫條件對UHT零乳糖奶中HMF與F的含量具有顯著影響，結(jié)果如圖5所示。高溫條件與常溫避光條件相比HMF含量明顯升高，高溫保存條件下HMF的含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，HMF含量由132.46 μg/100 g逐增至1 689.01 μg/100 g；而在推薦保存條件即常溫避光保存條件下，HMF由132.46 μg/100 g升高至203.55 μg/100 g左右，含量變化較小；高溫條件與常溫避光條件的F含量差異也明顯，高溫條件下F含量由3.69 μg/100 g逐漸升至89.67 μg/100 g；而常溫避光保存下第30天的F含量與第0天相比無顯著變化，F(xiàn)的含量在3.64～6.27 μg/100 g范圍內(nèi)波動。

圖5 零乳糖奶在兩種保存條件下糠醛類化合物的含量變化

3 結(jié)論

試驗研究發(fā)現(xiàn)，乳糖酶添加、加工工藝以及60 ℃高溫貯存影響了零乳糖奶樣中糠醛類化合物的生成，且對HMF的含量差異影響較大。具體體現(xiàn)：（1）酶解試驗中，HMF在乳糖酶添加后含量迅速上升，同種工藝條件下的零乳糖奶中HMF含量也明顯高于對應的普通奶樣，這可能是由于乳糖水解生成的葡萄糖和半乳糖的單糖體系相對于雙糖體系，美拉德反應更加劇烈，促進了HMF和F的生成；（2）不同加工工藝下，零乳糖奶中的HMF含量存在差異，UHT工藝由于較高的熱加工條件，導致了UHT零乳糖奶的HMF含量顯著高于UHT滅菌奶；（3）加速保存試驗證明了HMF含量和F含量均在高溫保存條件下明顯上升。此次研究提示，為確保居民乳品攝入的安全、優(yōu)質(zhì)，乳品行業(yè)在零乳糖奶的推薦推廣、工藝優(yōu)化、安全儲存等方面任重道遠。