甘薯多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)及電解水對其酶活力抑制效果

于章龍，劉瑞，孫元琳，周素梅，符喜春

1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所（運(yùn)城 044000）；2.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系（運(yùn)城 044000）；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（北京 100193）

甘薯（Ipomoea batatasL.）是我國四大經(jīng)濟(jì)作物之一，產(chǎn)量居世界之首；在我國主要的糧食作物中，僅次于水稻、小麥和玉米，居第四位[1]。其味道甜美、營養(yǎng)價值高，含有豐富的淀粉、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)元素等，還富含類黃酮、酚酸等天然抗氧化成分，是天然的“生理堿性”食物，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)酸堿平衡、提高免疫力、促進(jìn)消化和防癌等作用[2-4]。近年來，國內(nèi)對甘薯進(jìn)行了大量的深加工研究，開發(fā)出了紅薯干、紅薯蛋白質(zhì)、紅薯膳食纖維、紅薯飲料、紅薯變性淀粉等產(chǎn)品，并在甘薯化學(xué)物質(zhì)提取、分離純化和生物活性方面進(jìn)行了深入研究[5-8]。但由于甘薯組織特別是皮層中含有多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），在甘薯加工過程中PPO與多酚類物質(zhì)接觸，催化多酚類物質(zhì)氧化成鄰醌，再進(jìn)一步氧化聚合成黑色素[9]，使甘薯加工品品質(zhì)下降，從而制約了甘薯深加工產(chǎn)業(yè)開發(fā)。因此，深入研究甘薯褐變機(jī)理、控制甘薯在加工過程中的褐變，對提高甘薯產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值、充分利用我國豐富的甘薯資源具有重要意義。

目前，抑制酶促褐變的方法有多種。其中常用的抑制劑有亞硫酸鹽、抗壞血酸、檸檬酸、金屬離子、電解水等，但經(jīng)亞硫酸鹽處理的食品有化學(xué)殘留，對身體會造成一定的傷害[10]。電解水是經(jīng)直流電電解稀鹽溶液所獲得的酸性電解水和堿性電解水的總稱。前人研究表明電解水可有效控制蝦、山藥、蓮藕、蘑菇、馬鈴薯酶促褐變[11-15]。此次研究以晉甘9號為試驗(yàn)材料，通過研究其PPO的酶學(xué)性質(zhì)，從而確定PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長、PPO的最適作用pH和最適作用溫度，研究常見抑制劑和電解水對PPO活力的影響，創(chuàng)新抑制方式，為有效控制甘薯加工過程中的酶促褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

晉甘9號甘薯，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-9000S型雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；XY-L-150電生功能滅菌水生成器，寶雞新宇光機(jī)電有限責(zé)任公司；PH-550 pH計，陸恒生物股份有限公司；萬分之一精密電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TG16G臺式離心機(jī)，天津廣豐科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘薯 PPO粗酶液的制備[17]

將洗凈瀝干后的甘薯刮去外層表皮，取甘薯外圍1 cm寬的部分備用[16]。稱取30 g上述樣品，加入40 mL預(yù)冷至-18 ℃的丙酮并勻漿，抽濾得濾餅。用冷風(fēng)將濾餅吹至無丙酮味，即得甘薯丙酮粉。稱取1 g丙酮粉，加入19 mL預(yù)冷至4 ℃的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，振蕩充分混合，然后于11 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液，于4 ℃冷藏備用。

1.3.2 PPO 酶促反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長的測定

準(zhǔn)確量取1.2 mL甘薯PPO粗酶液、0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，混合搖勻，反應(yīng)12 min后在300～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。掃描時間為300 s，每隔5 s記錄吸光度變化，從而確定PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長。

1.3.3 PPO酶活力的測定

在比色皿中加入1.2 mL PPO粗酶液、0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，在410 nm波長處每隔5 s記錄吸光度的變化，記錄時間為2 min。以每分鐘使吸光度增加0.01所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 PPO最適pH的測定

配制pH分別為3.8，4.8，5.8，6.8，7.8和8.8的磷酸氫二納-檸檬酸緩沖液。取1.2 mL PPO粗酶液，分別與0.8 mL上述不同pH的緩沖液混合搖勻，2 min后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm測吸光度變化，并計算PPO酶活力。

1.3.5 PPO最適溫度的測定

取1.2 mL PPO粗酶液和0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，混合搖勻，分別放入20，30，40，50和60 ℃恒溫水浴鍋中保溫8 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm測吸光度變化，并計算PPO酶活力。

1.3.6 PPO酶促動力學(xué)參數(shù)的測定

取1.2 mL PPO粗酶液，與0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合均勻，3 min后分別加入1 mL 0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mol/L鄰苯二酚溶液，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，測定不同濃度底物下PPO的活力，作雙倒數(shù)曲線，求得PPO酶促動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。

1.3.7 不同金屬離子對PPO活力的影響

配制0.01，0.015，0.02，0.025和0.03 mol/L的氯化鈉溶液。取1.2 mL PPO粗酶液和0.8 mL上述不同濃度的氯化鈉溶液（對照為等量的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液），混合搖勻，反應(yīng)3 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，計算酶活力。

0.01 ，0.015，0.02，0.025和0.03 mol/L的氯化鎂、氯化鉀溶液對甘薯PPO酶活力的影響按上述方法測定。

1.3.8 檸檬酸、抗環(huán)血酸對PPO活力的影響

配制0.02，0.05，0.1，0.2和0.3 mol/L的檸檬酸溶液。取1.2 mL PPO粗酶液和0.8 mL上述不同濃度的檸檬酸溶液（對照為等量的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液），混合搖勻，反應(yīng)3 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，計算酶活力。

0.05 ，0.1，0.11，0.13和0.15 mol/L的抗環(huán)血酸對PPO活力的影響測定方法同上。

1.3.9 電解水的制備和理化指標(biāo)的測定

以氯化鈉溶液為電解質(zhì)，通過調(diào)整電解水發(fā)生裝置的電流及電解時間制取不同理化指標(biāo)的電解水。電解水的pH用pH計測定，有效氯濃度（ACC）用碘量法測定。此次使用的電解水理化指標(biāo)如表1所示。

表1 電解水理化指標(biāo)

1.3.10 不同有效氯濃度電解水對甘薯PPO活性的影響

不同有效氯濃度電解水理化指標(biāo)見表1，包括AEW 1（pH 3.35，ACC 20.39 mg/L），AEW 2（pH 3.33，ACC 31.58 mg/L）和AEW 3（pH 3.33，ACC 42.31 mg/L）。取1.2 mL PPO粗酶液，分別與0.8 mL不同有效氯濃度的電解水（對照為等量的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）混合搖勻，反應(yīng)3 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，計算酶活力。

1.3.11 不同pH電解水對甘薯PPO活性的影響

不同pH電解水理化指標(biāo)見表1，包括AEW 4（pH 3.50，ACC 32.26 mg/L），AEW 5（pH 4.50，ACC 32.26 mg/L）和AEW 6（pH 5.50，ACC 34.55 mg/L）。不同pH電解水對甘薯PPO活性影響的測定參照1.3.10。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)至少進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，將數(shù)據(jù)匯總后取平均值，用SPSS 22.0中的Duncan方差分析比較處理組間的差異顯著性，顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長

甘薯PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物在300～600 nm范圍內(nèi)的吸光度曲線如圖1所示。在373～410 nm范圍內(nèi)，隨著波長的增加，吸光度逐漸增大；在410～600 nm范圍內(nèi)，隨著波長的增加，吸光度逐漸降低。所以甘薯PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物在410 nm處有最大吸收峰。此結(jié)果與田玉庭[18]研究的青蘋果多酚氧化酶的最適波長410 nm結(jié)論一致。

圖1 甘薯PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物全波長掃描圖

2.2 PPO的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 PPO最適pH

由圖2可知，甘薯PPO活力在pH 4.8時達(dá)到極大值，這與李利華[19]研究的萵筍多酚氧化酶的最適作用pH 5.0相近。當(dāng)pH小于4.8或者大于4.8時，酶活性下降，說明甘薯PPO的活性在偏酸和偏堿的條件下都非常敏感。其原因是PPO為堿性蛋白質(zhì)，在較強(qiáng)的酸性條件下，輔基銅將以銅離子的形式解離出來，從而使酶失活，而在堿性條件下，輔基銅會解離成Cu(OH)2，使酶活力顯著減低[20]。

圖2 pH對甘薯PPO活力的影響

2.2.2 PPO最適溫度

由圖3可知，當(dāng)溫度為30 ℃時，甘薯PPO活性達(dá)到極大值，此結(jié)果與韓秋敏等[21]研究的紫薯多酚氧化酶的最適作用溫度30 ℃的結(jié)論一致。

圖3 不同溫度對甘薯PPO活性影響

2.2.3 PPO酶促動力學(xué)研究

依據(jù)Line weaver-Burk作圖，見圖4。線性回歸方程為y=0.000 6x+0.013 8（R2=0.993 2）。最大反應(yīng)速率Vmax=72.46 U，米氏常數(shù)Km=0.044 mol/L。Km是酶的特征物理常數(shù)之一，底物與酶的親和力由Km大小體現(xiàn)。1/Km越大，表明酶對底物的親和力越大，反之則越弱。

圖4 甘薯PPO的Line weaver-Burk圖

2.3 金屬離子對甘薯PPO活力的影響

由圖5可以看出，鎂、鈉、鉀離子對PPO均有一定抑制效果，其中0.03 mol/L NaCl、0.015 mol/L MgCl2和0.01 mol/L KCl對PPO酶活力抑制率較大，分別為23.19%，28.35%和29.77%。

圖5 金屬離子對甘薯PPO酶活力的影響

2.4 檸檬酸、抗壞血酸對甘薯PPO活力的影響

由圖6可看出，當(dāng)檸檬酸濃度為0.30 mol/L時抑制效果最好，抑制率為23.89%。這可能與加入檸檬酸后改變了反應(yīng)體系pH以及檸檬酸本身作為螯合劑與PPO中的銅離子結(jié)合共同作用降低了PPO活性有關(guān)。由圖6可知，隨著抗壞血酸濃度的增加，其對甘薯PPO的抑制作用隨之增強(qiáng)。當(dāng)抗壞血酸的濃度為0.15 mol/L時抑制效果最佳，抑制率可達(dá)74.15%。相比檸檬酸的抑制效果而言，抗壞血酸對PPO抑制效果更好。

圖6 檸檬酸、抗壞血酸對甘薯PPO活性的影響

2.5 電解水對甘薯PPO活性的影響

由圖7可知，隨著強(qiáng)酸性電解水有效氯濃度的逐漸增加，其對PPO活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)，pH 3.33、有效氯濃度42.31 mg/L的強(qiáng)酸性電解水對甘薯PPO抑制率可達(dá)65.30%。隨著電解水pH的增加，其對甘薯PPO活力的抑制作用略有下降，即強(qiáng)酸性電解水對甘薯PPO活力的抑制效果要好于微酸性電解水。

圖7 電解水對甘薯PPO活性的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)以鄰苯二酚為底物，磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液，利用分光光度法對晉甘9號甘薯多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)、酶促動力學(xué)參數(shù)以及部分金屬離子、檸檬酸、抗壞血酸和電解水對其酶活力抑制效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，甘薯PPO酶促反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長為410 nm，PPO最適作用pH為4.8，最適作用溫度為30℃，PPO最大反應(yīng)速率Vmax為72.46 U，米氏常數(shù)Km為0.044 mol/L。氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂對甘薯PPO均具有一定的抑制作用，其中0.01 mol/L KCl對PPO酶活力抑制率可達(dá)29.77%?？箟难釋Ω适鞵PO的抑制效果優(yōu)于檸檬酸。其中0.15 mol/L的抗壞血酸對PPO的抑制率可達(dá)74.15%。強(qiáng)酸性電解水可有效抑制甘薯PPO活力，其中pH 3.33、有效氯質(zhì)量濃度42.31 mg/L的強(qiáng)酸性電解水對甘薯PPO抑制率可達(dá)65.30%。此研究為有效抑制甘薯PPO活力提供了新方法。