孫飛,黃用豪
(天津市人民醫(yī)院麻醉科,天津300121)
結直腸癌是消化道最常見惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、惡性程度高、預后不良等特點,嚴重危害人類生命健康[1-2]。結直腸癌細胞持續(xù)性無限增殖、浸潤及轉移是導致患者死亡的主要原因。七氟醚是臨床常用的吸入性麻醉藥物,廣泛應用于多種手術,與惡性腫瘤關系密切,參與膠質瘤、骨肉瘤、乳腺癌等腫瘤細胞生物學行為變化過程[3-5]。microRNA(miRNA)是一類非編碼RNA,參與細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生理過程,microRNA-203(miR-203)是miRNA 家族中重要一員,是抑癌非編碼小分子RNA 之一,其表達水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關[6]。既往研究發(fā)現(xiàn),七氟醚可以通過調控miR-203 表達影響腫瘤細胞生物學行為,但其在結直腸癌方面報道較少[7]。本研究通過體外實驗觀察七氟醚對人結直腸癌HCT116細胞侵襲、遷移的影響以及對miR-203 的調控作用,探討其可能作用機制,為臨床診治結直腸癌提供理論參考。
1.1.1 細胞系人結直腸癌細胞株HCT116 購于中國科學院上海細胞庫。
1.1.2 藥物、主要試劑和儀器七氟醚(美國Baxter公司),DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司),Transwell 細胞培養(yǎng)小室(美國Corning 公司),900 型麻醉機(美國歐美達公司),miR-203 過表達質粒及相應空載體質粒(上海吉凱基因化學技術有限公司),兔抗人細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)多抗、p-ERK 多抗和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)多抗(美國CST 公司),山羊抗兔IgG-HRP(美國Abcam 公司)。
1.2.1 細胞培養(yǎng)人結直腸癌HCT116 細胞接種于DMEM 培養(yǎng)基(質量分數(shù)10% FBS+100 u/ml 青霉素+100 μg/ml 鏈霉素),置于體積分數(shù)5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng),2~3 d 傳代1 次,取對數(shù)增殖期細胞用于后續(xù)實驗。
1.2.2 細胞分組及干預轉染前1 d,將HCT116 細胞按2×105個/孔接種于6 孔板中,置于體積分數(shù)5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng),待細胞貼壁后,參照LipofectamineTM2000 轉染試劑說明書分別將miR-203 mimics 和 miR-203 mimics-NC 轉染至HCT116 細胞,轉染后培養(yǎng)24 h。根據(jù)轉染和培養(yǎng)條件分組:對照組(5% CO2培養(yǎng)+未轉染)、七氟醚組(4%七氟醚+5% CO2培養(yǎng)+未轉染),miR-203組(5%CO2培養(yǎng)+轉染miR-203 mimics)、miR-203+七氟醚組(4%七氟醚+5% CO2培養(yǎng)+轉染miR-203 mimics),miR-203-NC+七氟醚組(4%七氟醚+5% CO2培養(yǎng)+轉染miR-203 mimics-NC)。轉染后24 h 后,置于熒光顯微鏡下觀察,發(fā)出綠色熒光的為陽性細胞,隨機選取20 個視野計數(shù),計算轉染效率。轉染效率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。
1.2.3 CCK-8 實驗檢測細胞抑制率采用CCK-8實驗檢測細胞的增殖能力。各組細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,各個時間點結束前4 h,每孔加入10 μl CCK-8溶液,每組設置5個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,加入DMSO 150 μl/孔,充分振蕩10 min 后,用酶標儀在波長450 nm 處測定各孔光密度(OD)值,實驗重復3 次,計算細胞抑制率。抑制率(%)=(1-實驗組OD 值/對照組OD 值)×100%。
1.2.4 qRT-PCR 法檢測miRNA-203 表達胰酶消化收集各組細胞,采用Trizol 試劑提取總RNA,分光光度儀檢測所提RNA 的濃度和純度,按照逆轉錄試劑盒逆轉錄cDNA,按照Real-time 定量PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR 擴增。反應體系包括:正反向引物各1 μl,cDNA 模板1 μl,2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl,加ddH2O至總體積20 μl。反應條件:95℃預變性10 min,95℃變性30 s,57℃退火30 s,70℃延伸30 s,循環(huán)40 次,分析熔解曲線,反應結束后計算Ct 值,實驗重復3 次,取平均值。引物由上海吉瑪公司設計合成,以U6為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計算miR-203 相對表達量。引物序列見表1。
表1 引物序列
1.2.5 細胞遷移能力檢測將各組細胞以5×106個/ml 密度接種于6 孔板,當細胞融合達90%時,用無菌移液槍頭在細胞表面垂直劃線,棄去培養(yǎng)基,PBS 洗滌3 次后在劃痕處拍照(0 h),更換培養(yǎng)基后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),分別于12 h 和24 h 拍照,測量劃痕間距,計算細胞遷移率。遷移率(%)=(0 h 劃痕距離-各時間劃痕距離)/0 h 劃痕距離×100%。
1.2.6 細胞侵襲能力檢測以1∶2 稀釋的Matrigel基質膠鋪于Transwell 小室上室,加入不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基,于培養(yǎng)箱中靜置1 h。對細胞進行饑餓處理,密度調整為2×105個/ml,取200 μl 細胞懸液接種于Transwell 小室上室,下室加入500 μl含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基,置于體積分數(shù)5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h,用棉簽擦去上室多余細胞,每孔加入1 ml 多聚甲醛進行固定,固定30 min 后,用0.1%結晶紫染色30 min,吸去染色液,PBS 洗滌3 次,晾干后于顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞量,以穿膜細胞數(shù)作為細胞侵襲力評價指標,每孔隨機選取5 個視野,取平均數(shù)。
1.2.7 各組細胞ERK、p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達量的檢測收集各組細胞,加入Ripa 裂解液,冰上裂解,離心后收集上清,用BCA 法檢測蛋白濃度并定量,蛋白樣品與上樣緩沖液混合,沸水浴加熱使蛋白變性,配制10%聚丙烯酰胺凝膠,進行SDS-PAGE,轉至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別加入稀釋1∶500 的EPK、p-EPK、MMP-9、β-actin 一抗,4 ℃搖床孵育過夜,PBS 洗滌3 次,加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育2 h,PBS 洗滌3 次,加入ECL 化學發(fā)光試劑,顯影、定影,以β-actin 為內(nèi)參,采用Image J 圖像分析軟件分析條帶灰度值,目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值表示。每組均設5 個復孔。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
轉染miR-203 mimics 和miR-203 mimics-NC 均有熒光表達,轉染率≥85%,可用于后續(xù)實驗。見圖1。
圖1 細胞轉染效果 (×200)
七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細胞24 h、48 h、72 h 抑制率比較,采用重復測量設計的方差分析,結果:①不同時間點細胞抑制率有差異(F=49.586,P=0.000);②各組細胞抑制率有差異(F=43.267,P=0.000);③各組細胞抑制率變化趨勢有差異(F=41.258,P=0.000)。見表2。
表2 各組細胞抑制率的比較 (n=5,%,±s)
表2 各組細胞抑制率的比較 (n=5,%,±s)
組別七氟醚組miR-203組miR-203+七氟醚組miR-203-NC+七氟醚組24 h 20.13±2.21 22.36±2.48 36.49±3.78 23.84±2.67 48 h 36.48±3.89 37.59±3.91 50.81±5.15 35.48±3.75 72 h 45.61±4.87 48.17±5.02 63.59±6.58 47.26±4.93
對照組、七氟醚組、miR-203組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細胞的miRNA-203 相對表達量分別為:(0.52±0.07)、(1.75±0.18)、(1.78±0.18)、(2.35±0.25)和(1.71±0.17),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=65.702,P=0.000)。七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細胞的miR-203 相對表達量較對照組升高,且以miR-203+七氟醚組最高(P<0.05);七氟醚組、miR-203組、miR-203-NC+七氟醚組細胞的miR-203 相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
各組細胞12 h 和24 h 遷移率比較,采用重復測量設計的方差分析,結果:①不同時間點細胞遷移率有差異(F=86.523,P=0.000);②各組細胞遷移率有差異(F=64.158,P=0.000);③各組細胞遷移率變化趨勢有差異(F=102.557,P=0.000)。見表3 和圖2。
表3 各組細胞遷移率比較 (n=5,%,±s)
表3 各組細胞遷移率比較 (n=5,%,±s)
組別對照組七氟醚組miR-203組miR-203+七氟醚組miR-203-NC+七氟醚組12 h 50.12±4.86 20.36±3.01 22.81±2.52 12.59±1.85 19.58±3.14 24 h 81.15±8.53 37.53±6.71 44.67±6.85 20.37±3.21 40.67±6.54
圖2 各組細胞遷移距離比較 (×100)
對照組、七氟醚組、miR-203組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組穿膜細胞數(shù)分別為(146.20±15.16)個、(82.40±10.01)個、(80.6±10.21)個、(35.20±4.13)個、(85.80±10.06)個,經(jīng)單因素方差分析,各組穿膜細胞數(shù)量有差異(F=71.226,P=0.000)。七氟醚組、miR-203組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組穿膜細胞數(shù)量均較對照組減少,且miR-203+七氟醚組穿膜細胞最少(P<0.05)。七氟醚組、miR-203 組、miR-203-NC+七氟醚組穿膜細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。
圖3 各組細胞穿膜數(shù)量比較 (×200)
各組細胞p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達量有差異(F=80.679 和83.729,均P=0.000)。七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組細胞p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達量較對照組降低,且以miR-203+七氟醚組最低(P<0.05)。七氟醚組、miR-203 組、miR-203-NC+七氟醚組細胞p-ERK、MMP-9 蛋白相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組ERK 蛋白相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4 和圖4。
表4 各組細胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白相對表達量比較 (n=5,±s)
表4 各組細胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白相對表達量比較 (n=5,±s)
組別對照組七氟醚組miR-203組miR-203+七氟醚組miR-203-NC+七氟醚組ERK 1.03±0.11 1.10±0.12 1.05±0.11 1.07±0.12 1.11±0.12 p-ERK 0.95±0.10 0.46±0.05 0.45±0.05 0.28±0.03 0.49±0.06 MMP-9 1.08±0.11 0.51±0.05 0.53±0.06 0.34±0.04 0.55±0.06
圖4 各組細胞ERK、p-ERK、MMP-9蛋白表達電泳圖
手術是結直腸癌的主要治療方法,但術后易轉移、易復發(fā)、預后差,因此,研究探討結直腸癌發(fā)生、發(fā)展機制對其診斷、治療及預后有重要意義。七氟醚是臨床腫瘤切除術中常用麻醉藥,其對患者認知功能損害小,可有效改善患者術后血液流變學指標,降低手術引起的免疫抑制,降低血液黏稠度,減少血栓發(fā)生率[8-9]?;谄叻言诮Y直腸癌中的生物學作用,本研究通過探討七氟醚對結直腸癌侵襲、遷移機制的影響,以期為結直腸癌診斷、治療及預后提供新途徑,為提高患者生存率提供新的理論參考[10]。
侵襲和轉移是腫瘤細胞顯著的惡性生物學特征,是導致預后不良的主要因素,也是臨床抗腫瘤治療失敗和導致患者死亡的主要原因。惡性腫瘤侵襲和轉移是多種因素及多個基因相互調控的復雜過程,抑制腫瘤細胞侵襲和遷移對提高患者生存質量具有重要意義[11]。既往研究證實,七氟醚可抑制腫瘤細胞增殖及轉移,在抗腫瘤方面顯示獨特作用,對患者生存率產(chǎn)生一定影響[12]。DING 等[13]研究發(fā)現(xiàn),七氟醚通過靶向Ras 蛋白和靶向RhoA 蛋白抑制宮頸癌細胞增殖和遷移。KANG 等[14]研究顯示,七氟醚通過調節(jié)JNK 和p38 MAPK 信號通路影響卵巢癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。本研究七氟醚組細胞遷移率顯著降低,穿膜細胞數(shù)量顯著減少,表明七氟醚能抑制HCT116細胞侵襲和遷移。
CHI 等[15]研究顯示,miR-203 可通過靶向下游相關基因抑制肺小細胞癌增殖和遷移。ZHANG 等[16]研究發(fā)現(xiàn),miR-203 可通過調控RGS17 抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。本研究miR-203 組穿膜細胞顯著減少、細胞遷移率顯著下降,表明過表達miR-203 可抑制HCT116 細胞侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn),miR-203 在結直腸癌組織及細胞中的表達較正常結直腸組織、細胞異常降低,在結直腸癌發(fā)病過程中發(fā)揮重要調控作用,影響結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移[17]。本研究對照組miR-203 低表達,與以上研究結果一致,同時miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組miR-203 表達顯著升高,其中miR-203+七氟醚組miR-203 表達更高,提示七氟醚可能對miR-203 有調控作用。CHEN 等[18]研究表明,七氟醚可通過調節(jié)miR-203 表達抑制人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。LIU等[19]研究發(fā)現(xiàn),七氟醚可通過調節(jié)miR-203 表達抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。由此表明,七氟醚能抑制HCT116細胞侵襲和遷移,可能是通過調控miR-203 表達發(fā)揮抑制作用。
ERK 參與腫瘤增殖、凋亡、侵襲及遷移過程,是MAPK 信號通路之一,p-ERK 是衡量ERK 信號通路的活性指標,持續(xù)活化的ERK 通路有助于正常細胞向腫瘤表型轉化。MMP-9 是重要蛋白水解酶,在多種腫瘤中表達,通過降解細胞外基質,增強細胞侵襲力和轉移力,促進腫瘤細胞侵襲和遷移。ERK活化可激活下游MMP-9,提高腫瘤細胞侵襲轉移能力。研究發(fā)現(xiàn),阻斷ERK 信號通路可以降低人骨肉瘤細胞活力,抑制其增殖、遷移、侵襲[20]。另有研究顯示,葒草苷可以通過阻斷ERK 信號通路下調MMP-9 表達來抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移[21]。本研究七氟醚組、miR-203 組、miR-203+七氟醚組、miR-203-NC+七氟醚組p-ERK、MMP-9 蛋白水平顯著下降,表明ERK 信號通路被阻斷,從而影響HCT116 細胞侵襲和遷移。研究表明,miR-203 可以通過破壞ERK/MMP-9 信號軸抑制神經(jīng)膠質瘤細胞遷移[22]。另有研究顯示,在乳腺癌細胞中,小干擾RNA 通過升高miR-203 表達,下調MMP-9 表達抑制腫瘤細胞侵襲和遷移[23]。本研究miR-203+七氟醚組p-ERK、MMP-9 蛋白水平下降最顯著,表明七氟醚對HCT116 細胞的抑制作用可能是通過上調miR-203表達,阻斷ERK/MMP-9 通路,從而發(fā)揮抑制細胞侵襲和遷移作用。
綜上所述,七氟醚有顯著抑制人結直腸癌HCT116 細胞侵襲和遷移作用,其作用機制可能是通過上調miR-203 表達、阻斷ERK/MMP-9 通路發(fā)揮調控作用,為臨床診治結直腸癌提供理論參考。