紅三葉異黃酮在刈割6 h內(nèi)的變化規(guī)律

馮紀(jì)銘，何春燕，劉 權(quán)，齊 開(kāi)，莫海鳳

(蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州大學(xué)草業(yè)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，蘭州 730020)

刈割是牧草常見(jiàn)的生產(chǎn)方式，能有效提高單位面積牧草產(chǎn)量，但會(huì)對(duì)植物體造成機(jī)械傷害，導(dǎo)致植物體內(nèi)氧自由基的大量增加，造成膜脂過(guò)氧化，影響植物生長(zhǎng)[1-3]。牧草在受到外界干擾的情況下具有補(bǔ)償性和均衡性生長(zhǎng)的特性，刈割正是通過(guò)牧草的這一特性來(lái)提高牧草產(chǎn)量[4-5]，因此，刈割管理需尋求外界干擾和自我補(bǔ)償?shù)钠胶恻c(diǎn)。針對(duì)不同牧草、不同種植區(qū)域，此前開(kāi)展了大量關(guān)于刈割時(shí)期、頻次與強(qiáng)度等因素對(duì)牧草產(chǎn)量和品質(zhì)影響的研究。研究結(jié)果表明，適當(dāng)刈割能夠提高牧草生產(chǎn)力，且可以通過(guò)提升牧草中粗蛋白和粗灰分含量，降低酸性洗滌纖維含量，改善牧草品質(zhì)[6-7]。植物體能夠通過(guò)調(diào)節(jié)其生理生化物質(zhì)含量及活性，清除體內(nèi)的過(guò)量自由基，維持其正常的生命活動(dòng)。然而，當(dāng)前關(guān)于牧草在受到刈割后短時(shí)間內(nèi)生理生化指標(biāo)的變化及其再生機(jī)理的研究相對(duì)較少。

紅三葉(TrifoliumpratenseL.)為優(yōu)良的豆科牧草[8]，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。其植物體中含有大量的異黃酮類化合物[9]，被用于治療女性更年期綜合癥[10]、緩解抑郁焦慮情緒[11]；作為飼料，可以促進(jìn)家畜的生長(zhǎng)，提高家畜的屠宰性能，提高家畜產(chǎn)品的品質(zhì)[12-13]。紅三葉中異黃酮類化合物主要為鷹嘴豆素A、芒柄花素、染料木素和大豆苷元[14-15]，具有良好的抗氧化活性，能夠清除氧自由基[16-17]，是植物抗逆過(guò)程中的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，異黃酮類化合物是該植物群落的競(jìng)爭(zhēng)武器，具有植物毒活性，對(duì)紅三葉的生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)具有重要作用[18]。

當(dāng)前，刈割方面的研究主要集中在刈割頻次、留茬高度與產(chǎn)量的關(guān)系。有研究表明，在豆禾混播草地中，禾草混播比例75%、施氮肥和磷肥均為0.15t/hm2、每年刈割3次的產(chǎn)量最高[19]。在紅三葉和黑麥草混播草地中，紅三葉產(chǎn)量變化明顯，且其變化主導(dǎo)總產(chǎn)量的變化，相對(duì)較低的留茬和較高的刈割頻次均使得紅三葉產(chǎn)量增加[20]，在紅三葉與鴨茅的混播草地中的研究結(jié)論與之相同[21]。因此，當(dāng)前關(guān)于紅三葉刈割的研究主要基于草地生產(chǎn)力，關(guān)于紅三葉刈割后短時(shí)間內(nèi)應(yīng)激機(jī)理的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以‘炫麗’(T.pratensecv. ‘Brilliant’)和‘海發(fā)’(T.pratensecv.‘Haifa’) 紅三葉為研究對(duì)象，進(jìn)行間隔3h的3次連續(xù)刈割，通過(guò)分析異黃酮總含量及4種異黃酮類化合物含量隨刈割次數(shù)的變化情況，研究在6h內(nèi)紅三葉植物體內(nèi)異黃酮含量響應(yīng)刈割刺激的變化規(guī)律，為生產(chǎn)中以異黃酮生產(chǎn)為目的紅三葉收獲方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

‘海發(fā)’和‘炫麗’紅三葉種植于蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室，在初花期對(duì)其進(jìn)行刈割。紅三葉在盛花期代謝旺盛，異黃酮含量較高[8]，但葉量下降極為明顯，因此本試驗(yàn)參考生產(chǎn)實(shí)際，選擇在初花期進(jìn)行刈割[22]。

第1次刈割保留地上20 cm，第2次刈割保留地上5 cm，第3次齊地刈割，每次刈割間隔3 h，3個(gè)重復(fù)。刈割所得地上部分分離莖稈和葉片，其中第3 次刈割僅得莖稈部分。所得樣品在60 ℃下烘干，粉碎，備用。第1 次刈割收集的樣品為植物處于未受到刈割的狀態(tài)，并以此作為后2 次刈割處理的對(duì)照。

1.2 方 法

1.2.1 異黃酮總含量測(cè)定 取11.9 mg芒柄花素溶于10 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，取0.5 mL稀釋至10 mL，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、2.0、3.0 mL于9個(gè)10 mL容量瓶中，定容，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定275 nm處吸光值，得回歸方程：y=19.487x+0.0159，R2=0.999 5，x表示異黃酮溶液濃度，y表示吸光度值。

分別取0.1 g 3 次刈割所得莖稈、葉片的試樣于離心管中，加體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇10 mL，50 ℃超聲萃取30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液0.3 mL于10 mL容量瓶，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容，測(cè)定275 nm處吸光值，代入線性回歸方程，計(jì)算異黃酮總含量。

1.2.2 異黃酮類化合物含量測(cè)定 液相色譜為Agilent 1000 LC(Santa Clara, CA, USA)，VWD檢測(cè)器，反相 C18 柱(顆粒粒徑為 5 μm， 4.6 mm×250 mm，美國(guó))，柱溫 30 ℃。流動(dòng)相：A 相為體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水，B 相為色譜甲醇，流速 0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，進(jìn)樣量 20.0 μL。洗脫程序?yàn)椋?～5 min，40% B；10～ 20 min，70% B；35 min，85% B； 40 min，100% B。分別制備4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以3個(gè)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 24.0進(jìn)行成對(duì)樣本t檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 刈割所得地上部分質(zhì)量

從表1可見(jiàn)，紅三葉地上部分質(zhì)量均隨刈割次數(shù)增加而減少，差異顯著(P<0.05)，主要原因?yàn)榧t三葉具有直立生長(zhǎng)的特性。

表1 紅三葉刈割所得地上部分質(zhì)量Table 1 Mass of aboveground part of red clover obtained by mowing g

2.2 刈割對(duì)異黃酮總含量的影響

從表2可知，‘海發(fā)’和‘炫麗’紅三葉在每次刈割后異黃酮總含量均增加。 ‘炫麗’葉片的異黃酮總含量均高于‘海發(fā)’，但刈割處理后，‘海發(fā)’葉片的異黃酮總含量增幅為50.6%，高于‘炫麗’28.0%的增幅。刈割后6 h內(nèi)莖稈異黃酮總含量均有所增加，差異不顯著(P>0.05)。此外，兩品種莖稈中異黃酮總含量均低于葉片。

表2 紅三葉異黃酮總含量Table 2 Isoflavone contents of red clover %

2.3 刈割對(duì)葉片中異黃酮類化合物含量的影響

從表3可知，刈割前‘海發(fā)’葉片中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量均高于‘炫麗’，刈割處理后兩種化合物含量在‘海發(fā)’葉片中均降低，降幅為20.2%和15.6%，差異不顯著。而在‘炫麗’葉片中均顯著增加(P<0.05)，增幅為46.8%和 35.3%。刈割后兩種化合物在‘海發(fā)’葉片中的含量低于在‘炫麗’中的含量。大豆苷元和染料木素含量在‘炫麗’葉片中略有下降，在‘海發(fā)’葉片中增加，但差異均不顯著。

表3 葉片中異黃酮類化合物含量Table 3 Contents of three isoflavones in red clover leaves mg/g

4種化合物在葉片中含量為鷹嘴豆素A > 芒柄花素 > 大豆苷元 > 染料木素，刈割對(duì)其含量大小排序沒(méi)有影響。其中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量最多，染料木素在4種化合物中含量 最低。

2.4 刈割對(duì)莖稈中異黃酮類化合物含量的影響

由表4可知，刈割后‘炫麗’莖稈中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量均增加，在第 2 次和第 3 次刈割后增幅均高于70%，其中鷹嘴豆素A含量在第 2 次刈割后顯著增加(P<0.05),芒柄花素含量在第 1 次和第 2 次刈割后均顯著增加(P< 0.05)。鷹嘴豆素A含量在‘海發(fā)’莖稈中隨刈割次數(shù)增加而增加，差異不顯著，芒柄花素含量在第 1 次刈割后增加，在第 2 次刈割后略有下降，差異不顯著。此外，兩品種莖稈中大豆苷元含量均高于葉片，‘炫麗’莖稈中的含量隨刈割次數(shù)增加而增加，在第 3 次刈割時(shí)顯著增加(P<0.05)。‘海發(fā)’莖稈中大豆苷元含量略高于葉片，呈先增加后降低的趨勢(shì)，在第 1 次刈割后顯著增加(P< 0.05)，在第 2 次刈割后降低。除 ‘海發(fā)’第 2 次刈割樣品，染料木素在莖稈中的含量均高于對(duì)應(yīng)的葉片處理。莖稈中該化合物含量在‘炫麗’刈割后先顯著減少后增加，在‘海發(fā)’中表現(xiàn)為不斷降低,差異不顯著。

表4 紅三葉莖稈中異黃酮類化合物含量Table 4 Contents of isoflavones in red clover stems mg/g

3 討論與結(jié)論

植物與環(huán)境長(zhǎng)期相互作用和生存競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程中，形成一套完整的防御體系適應(yīng)環(huán)境脅迫，降低不利環(huán)境帶來(lái)的損害。一方面通過(guò)改變形態(tài)結(jié)構(gòu)作為機(jī)械/物理防御策略，另一方面則利用生理生化響應(yīng)作為化學(xué)防御策略[23]。

本試驗(yàn)比較了紅三葉在6 h內(nèi)2次刈割后異黃酮總含量及4種異黃酮類化合物含量的變化，結(jié)果表明，6 h內(nèi)刈割損傷使紅三葉植物體內(nèi)異黃酮總含量大幅增加。可能原因在于刈割會(huì)使植物體產(chǎn)生機(jī)械損傷，導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧自由基激增，而異黃酮具有抗氧化功能[16-17,24-25]，因此在植物體受到刈割后被大量合成以清除植物體內(nèi)的過(guò)量自由基，最大限度降低機(jī)體的損傷，維持植物的正常生命活動(dòng)。有研究表明，機(jī)械刺激會(huì)提高異黃酮合成關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶活性，通過(guò)提高次生代謝相關(guān)酶活性從而加強(qiáng)次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，激活植物體內(nèi)次生代謝防御系統(tǒng)[26]。此外，植物的應(yīng)激反應(yīng)模型表明，植物在正常狀態(tài)下初生代謝和次生代謝處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中，刈割作為一種較強(qiáng)的脅迫刺激會(huì)使該平衡產(chǎn)生波動(dòng)或出現(xiàn)混沌狀態(tài)，導(dǎo)致次生代謝的增強(qiáng)，即通過(guò)產(chǎn)生相應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物緩解和適應(yīng)逆境脅迫環(huán)境[27-28]。

葉片由大量薄壁細(xì)胞組成，而薄壁細(xì)胞是植物積累次生代謝產(chǎn)物的主要部位[8]。因此，兩品種紅三葉均表現(xiàn)為葉片異黃酮總含量高于莖稈，鷹嘴豆素A和芒柄花素在葉片中的含量高于莖稈，但大豆苷元和染料木素在葉片中的含量低于莖稈。此外，‘炫麗’的異黃酮總含量高于‘海發(fā)’，但‘海發(fā)’在刈割后其增幅高于‘炫麗’，可能原因在于不同品種響應(yīng)刈割刺激敏感度不同。不同的異黃酮類化合物在刈割6 h內(nèi)表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)?！披悺~片中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量在刈割處理后增加，‘炫麗’葉片中大豆苷元含量在刈割后略有下降，在‘海發(fā)’葉片和‘炫麗’莖稈中均增加，在‘海發(fā)’莖稈第 1 次刈割后增加，第 2 次刈割后下降。染料木素含量?jī)H在‘海發(fā)’葉片刈割處理后增加，在‘炫麗’葉片及莖稈中均降低。由于大豆苷元和染料木素含量較低，因此對(duì)異黃酮總含量變化影響較小。

雖然不同品種和部位異黃酮類化合物含量變化有所差別，但是刈割后整體上不同品種和部位異黃酮總含量均增加，充分說(shuō)明異黃酮是該植物受到機(jī)械損傷的主要抗逆和防御物質(zhì)之一。本研究結(jié)果將為紅三葉刈割后修復(fù)再生生產(chǎn)提供理論依據(jù)，為牧草生產(chǎn)科學(xué)管理與規(guī)劃提供參考。