獼猴桃細菌性潰瘍病可視化LAMP檢測方法的建立與應用

王一波，祝 山，郭文通，秦虎強，劉 巍，徐亮勝，黃麗麗

(西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 712100)

獼猴桃是一種重要的經濟作物，憑借其風味獨特、維生素C含量高、營養(yǎng)價值豐富，已經成為很多地區(qū)脫貧致富的支柱產業(yè)[1]。但是，由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的獼猴桃細菌性潰瘍病是制約獼猴桃產業(yè)發(fā)展的重大病害，已造成嚴重的經濟損失[2]。該病害發(fā)展迅速、危害嚴重、防治困難，已在亞、歐、澳、南美洲等地的主要獼猴桃產區(qū)廣泛流行，成為備受關注的世界性病害。獼猴桃細菌性潰瘍病在中國主要分布于陜西、四川、河南、貴州、浙江等省[3]。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，國內已建立多種基于PCR原理的Psa分子檢測方法。例如，Yao等[4]建立的四川省Psa病原菌特異性檢測方法；謝錦添等[5]建立的Psa實時熒光定量PCR檢測方法等。但這些檢測方法由于依賴價格昂貴的檢測設備，專業(yè)的檢測步驟，使其廣泛應用受到限制。因此，生產中亟需一種靈敏度、特異性、穩(wěn)定性能與PCR檢測相當，且不受實驗設備限制的檢測方法。

環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在2000年由Notomi等[6]建立的一種等溫擴增技術。憑借其特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測成本低等優(yōu)點，LAMP檢測技術被廣泛應用于各個領域，逐漸成為可以替代傳統(tǒng)PCR檢測的新檢測技術。LAMP反應過程依賴于靶標DNA6個獨立的區(qū)域，因而其特異性非常高。同時，LAMP反應在等溫條件下進行，使用能夠維持穩(wěn)定恒溫的設備(水浴鍋、保溫桶等)即可完成，而不需要PCR儀等昂貴設備，從而使檢測成本大幅降低，應用范圍顯著擴大；另外，檢測結果可通過加入多種染料呈現(xiàn)出可視化[7]。

Ruinelli等[8]已經針對Psa全球主要流行變種(Psa3)，同時也是中國主要流行種，設計了特異性LAMP檢測方法，但其檢測主要采用試劑盒，檢測結果判斷依賴熒光定量PCR儀觀察擴增曲線，并沒有發(fā)揮LAMP檢測技術操作簡便、檢測成本低等優(yōu)點。本研究旨在通過測試并優(yōu)化該LAMP反應體系、簡化檢測步驟、加入熒光染料SYBR green I等手段，來降低反應成本，減少操作步驟，建立一種便捷、可視化的LAMP快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 試驗所使用的5株獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌標準菌株、5株外源對照菌株均由西北農林科技大學果樹病害病原生物學及綜合防治研究團隊實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 試劑：LB培養(yǎng)基；Bst 2.0 DNA聚合酶，購自NEB公司。dNTP混合液、甜菜堿，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Eva Green，購自biotium公司；5×等溫擴增緩沖buffer[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，250 mmol/L KCl，50 mmol/L(NH4)2SO4，0.5% Tween-20)]。

儀器：熒光定量PCR儀(LC-96)購，購自Roche公司；PCR儀，購自thermoFisher公司；引物：參考Ruinelli等[8]的方法，所設計引物針對Psa 3，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 LAMP方法所用引物Table 1 Primer,sequence and length of LAMP

1.2 方 法

1.2.1 標準及對照菌株菌懸液制備 取-80 ℃低溫保存的各個菌液，于LB平板上劃線培養(yǎng)， 25 ℃活化48 h，挑取單菌落，于液體LB培養(yǎng)基中 25 ℃搖培14 h。取100 μL菌懸液置于1.5 mL離心管中，將其于沸水中煮沸15 min，作為DNA模板，備用。

1.2.2 LAMP反應體系優(yōu)化 針對LAMP反應主要影響因素，設置濃度梯度(Mg2+濃度0、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L、6 mmol/L、7 mmol/L；甜菜堿濃度0、0.5 mol/L、1 mol/L、1.5 mol/L、2 mol/L)，檢測單一變量下，反應體系的最優(yōu)反應濃度；設置6個反應溫度(60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、 65 ℃)，反應體系中加入Eva Green定量監(jiān)測反應進程，測試在不同甜菜堿濃度下反應最適濃度、不同溫度下反應最適溫度及時間；選擇最優(yōu)反應體系、最適反應溫度和最短時間。以標準菌株M228為陽性對照，滅菌水為陰性對照。

1.2.3 LAMP特異性測試 利用建立好的LAMP檢測體系，在最適溫度下，用不同菌種的DNA模板進行LAMP擴增，以滅菌水為陰性 對照。

1.2.4 LAMP靈敏性測試 通過分光光度計測定M228菌懸液的OD600值，用無菌水將菌懸液濃度調到OD600=0.1(108CFU/mL)。然后，將菌懸液濃度調到106CFU/mL，之后按10倍梯度稀釋7個濃度梯度。利用已建立的LAMP體系進行靈敏性測試，每個濃度重復3次，無菌水為陰性對照。

1.2.5 田間樣品LAMP檢測 分別于陜西眉縣、周至縣和楊凌區(qū)等地，在獼猴桃果園采集樹皮、根、葉片、果柄組織樣品共122份，其中樹皮樣品45份、根樣品14份、葉片樣品36份、果柄樣品12份、花樣品15份。經清水沖洗和75%酒精表面消毒后，用滅菌的手術刀切下1 cm長寬的植物組織，切碎并放置于1.5 mL離心管中，加入 1 mL無菌水，靜置10 min后，100℃水浴10 min，以懸浮液為模板，進行LAMP檢測。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應體系優(yōu)化結果

研究結果表明，獼猴桃細菌性潰瘍病LAMP檢測方法最適Mg2+濃度為2 mmol/L(圖1)；最適甜菜堿濃度為1.5 mol/L(圖2-A)；最終確定25 μL反應體系為：8 U Bst 2.0 DNA聚合酶，5 μL 5×等溫擴增緩沖Buffer，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1.5 mol/L甜菜堿,1.6 μL FIP和BIP,0.2 μL F3和B3，0.4 μL LoopF和LoopB(引物初始濃度為10 μmol/L)，1 μL模板DNA。其反應的最適溫度為65 ℃，并在反應約 25 min后達到平臺期，所以確定反應時間為30 min。

2.2 LAMP特異性檢測

于最適溫度下測試的特異性檢測結果顯示(圖3)：只有5株Psa菌株有明顯的陽性結果，而其他5株對照菌株及陰性對照均無顏色變化，表明建立的LAMP檢測方法具有良好的特異性。

2.3 LAMP靈敏性檢測

于最適溫度下測試的靈敏性檢測結果顯示(圖4)：LAMP檢測結果在菌懸液濃度分別為106、105、104、103、102CFU/mL時均可得到陽性檢測結果，因此LAMP檢測方法最低可以檢測到102CFU/mL的標準菌株菌懸液濃度。

2.4 田間樣品LAMP檢測

田間樣品檢測結果顯示(表2)，花樣品共采集并檢測15份，其中12份為陽性結果，帶菌率為 66.7%；葉片樣品共采集并檢測36份，其中23份為陽性結果，帶菌率為63.0%；果柄樣品共采集并檢測12份樣品，其中3份為陽性結果，帶菌率為25.0%；樹皮樣品共采集并檢測45份，其中35份為陽性結果，帶菌率為77.0%；根樣品共采集并檢測14份樣品，其中5份為陽性結果，帶菌率為35.7%。

表2 田間樣品檢測結果Table 2 Source,quantity,infected rate of field samples

3 討 論

由于獼猴桃細菌性潰瘍病具有擴展快、危害重、防治難等特點，所以病原菌的早期診斷對病害的精準防治尤為關鍵。因此，開發(fā)一種針對其病原菌的快速、準確的檢測方法為病害侵染早期有效識別和及時防治至關重要。

相比于PCR檢測或qRT-PCR，LAMP檢測具有明顯優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在：①特異性強，即反應所需的內外兩對引物基于目的基因的6個位點設計，檢測過程中必須與引物完全匹配才能擴增；②靈敏度高，即該檢測方法靈敏度一般比PCR低10倍[9]，但通過引物篩選，反應體系優(yōu)化等步驟可將檢測靈敏度提高。Duan等[10]在核盤菌高抗苯并咪唑菌株LAMP檢測方法的研究中，通過體系優(yōu)化，LAMP靈敏性比PCR高1 000倍；③設備簡單，即不需要專業(yè)的PCR儀及電泳設備，因為LAMP反應是恒溫擴增，通過簡單的水浴鍋或保溫杯等恒溫設備即可實現(xiàn)擴增；④反應時間短，即LAMP反應通常1 h內可完成，本研究優(yōu)化后的反應體系可于30 min內完成反應，相比于PCR長時間的反應過程及后續(xù)電泳結果判定，LAMP具有明顯的優(yōu)勢；⑤反應結果可視化，即在理論上，LAMP檢測結果可通過觀察反應擴增副產物焦磷酸鎂(白色沉淀)[11]直接判定結果。但通常情況下，并不會很容易觀察沉淀，所以可通過加入SYBR Green I[12]或者羥基萘酚藍(HNB)[6]等染料來使反應結果呈現(xiàn)出可視化。

本研究參考國外獼猴桃細菌性潰瘍病LAMP快速檢測方法，并在其基礎上進行一定優(yōu)化。首先是降低成本，通過建立并優(yōu)化反應體系，拋棄對試劑盒的依賴，降低檢測成本。然后通過使檢測結果的可視化，使檢測的結果判定不依賴于專業(yè)儀器，并且可以在反應完成后直接觀察檢測結果，從而提高檢測效率。同時，檢測的靈敏性達到102CFU/mL，完全可以用于田間檢測。

田間檢測結果揭示獼猴桃不同的組織部位均可帶菌，且?guī)Ь瘦^高，其中樹皮中帶菌率高達77.0%。此結果提示：在田間防治獼猴桃潰瘍病時要全面噴防藥劑，同時要重點關注幼枝樹皮、葉片和花等部位的防治。

獼猴桃細菌性潰瘍病嚴重威脅獼猴桃果樹的健康，阻礙中國獼猴桃產業(yè)的發(fā)展。本研究結合以往國外獼猴桃檢測方法建立的經驗，通過對反應體系的優(yōu)化、反應結果的可視化使LAMP檢測方法能夠得到更廣泛的應用，本研究結果無論對獼猴桃的引種栽培還是獼猴桃細菌性潰瘍病的季節(jié)性精準防治都具有借鑒作用。