非小細胞肺癌進展過程中miR-203對ABCE1的調(diào)節(jié)作用

周鏑，田野，楊雪鷹

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院胸外科，沈陽 110032）

肺癌是高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，自2018年以來，全球每年約有177萬人死于肺癌［1］。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的80%。在過去的幾十年里，NSCLC的診斷和治療水平得到了較大的提升，然而，只有約16%的患者能夠在早期得到診斷和治療，肺癌的5年生存率仍然低于20%［2］。因此，尋找更有價值的生物標志物和探索新的治療靶點是NSCLC治療中亟待解決的問題。

微RNA（microRNAs，miRNAs）是一種小的非編碼RNA分子，通過與相應(yīng)的靶點信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’非翻譯性區(qū)域（3’untranslation region，3’UTR）直接相互作用來調(diào)控基因表達［3］，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究［3］表明，miRNAs的錯誤表達與多種人類癌癥相關(guān)，有學者將其定義為腫瘤抑制因子或抑癌基因。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a/b/c、miR-135a、miR-203在NSCLC中均出現(xiàn)了不同程度的表達下調(diào)［4］，且有證據(jù)表明miR-203參與了多種腫瘤的發(fā)生［5-6］。但其在NSCLC發(fā)生及進展中的作用和機制尚不清楚。本研究通過檢測miR-203在人NSCLC組織中的表達情況，結(jié)合體外實驗，進一步研究miR-203在NSCLC中的作用，以期為NSCLC的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選取2018年至2019年于我科接受手術(shù)治療的NSCLC患者20例，術(shù)中留取新鮮NSCLC組織及其對應(yīng)的癌旁組織。所有患者均簽署知情同意書。本研究符合赫爾辛基宣言，并獲得中國醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

人NSCLC細胞系H1650和LTEP-a-2購自中國科學院細胞庫（上海）。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2 d傳代1次。將細胞分為對照組和miR-203過表達組2組。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)：用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA。按照PrimeScript RT試劑試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書進行互補DNA合成。采用正向引物5’-TCAAACTT CACAGGTTGCC-3’和反向引物5’-GATCATGTTCCA CCACAATG-3’檢測ABCE1轉(zhuǎn)錄水平。β-actin作為內(nèi)參，正向引物序列為5’-AGACCTGTACGCCAACAC AG-3’，反向引物序列為5’-CGGACTCGTCATACTC CTGC-3’。根據(jù)說明書，使用TaqMan miRNA分析（美國Applied Biosystems公司）試劑盒檢測成熟miR-203的表達水平，并使用U6小核RNA作為內(nèi)參。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的LTEP-a-2細胞按照3×105/孔接種于6孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中過夜。用2 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理4 h。在200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入2 μg DNA和2 μL PLUS試劑，室溫孵育10 min，然后加入200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基加入6 μL LTX試劑，配制成轉(zhuǎn)染工作液，室溫孵育30 min。棄掉孔中培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染工作液并將6孔板置于細胞培養(yǎng)箱中孵育。4 h后加入200 μL胎牛血清。轉(zhuǎn)染24～48 h后，進入功能試驗。

1.3.3 劃痕實驗：取出6孔板，用1 mL移液器吸頭在孔中垂直作一劃痕。用PBS清洗細胞3次，隨后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，拍照。將6孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出拍照。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：細胞處理24 h后，移去培養(yǎng)基，更換成無血清培養(yǎng)基，常規(guī)條件下培養(yǎng)饑餓24 h。收集細胞到離心管中，1 000 r/min離心5 min，加入4 ℃預冷的PBS重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。加入1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為（1～5）×106/mL。取100 μL細胞懸液至于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC 混勻后于室溫避光孵育5 min，加入10 μL PI染液，并加入400 μL PBS后進行上機檢測。采用Flowjo軟件對流式結(jié)果進行分析處理。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-203及ABCE1在NSCLC及癌旁組織的表達

采用實時PCR對20例NSCLC及癌旁組織進行檢測，結(jié)果顯示，NSCLC組織中miR-203平均表達水平（0.369±0.338）與癌旁組織（0.575±0.450）相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.019）。而NSCLC組織中的ABCE1表達水平（1.243±0.716），較癌旁組織（0.739±0.316）明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 6）。

2.2 miR-203在體外負性調(diào)節(jié)ABCE1的基因表達

由于miR-203在非小細胞肺癌的組織和細胞系中表達較低，miR-203水平相對較低的肺腺癌細胞系H1650、LTEP-a-2被用來評估m(xù)iR-203誘導的效果。采用miR-203 mimics模擬表達載體誘導miR-203表達，實時PCR結(jié)果顯示，miR-203在H1650、LTEP-a-2中表達分別達到1.954±0.099和5.631±0.282，較對照組（1.021±0.046和0.099±0.039）均有升高，提示過表達。實時PCR結(jié)果顯示，過表達miR-203在H1650和LTEP-a-2細胞中使ABCE1mRNA水平分別達到0.449±0.049和0.353±0.018，較對照組（1.009±0.156和1.005±0.060）降低50%以上，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），提示miR-203能夠抑制ABCE1表達。

2.3 miR-203在體外抑制NSCLC的遷移

劃痕實驗檢測miR-203過表達對H1650和LTEP-a-2細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，miR-203 mimics轉(zhuǎn)染的H1650和LTEP-a-2細胞遷移區(qū)域分別為0.354±0.035和0.456±0.016，與對照組（0.585±0.021、0.590±0.013）相比，轉(zhuǎn)染miR-203的細胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖1。

圖1 miR-203過表達對細胞遷移能力的影響Fig.1 Effects of miR-203 overexpression on cell migration

2.4 miR-203過表達誘導體外NSCLC細胞凋亡

流式細胞學檢測結(jié)果顯示，miR-203 mimics轉(zhuǎn)染的H1650和LTEP-a-2細胞中，凋亡細胞比例分別達到31.307%±1.420%和35.250%±0.512%，明顯高于對照組（13.068%±1.364%和19.313%±0.688%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），提示miR-203過表達能夠促進NSCLC細胞凋亡，見圖2。

圖2 miR-203過表達對H1650和LTEP-a-2細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of miR-203 overexpression on apoptosis of H1650 and LTEP-a-2 cells

3 討論

NSCLC的生存和預后相對較差，部分原因是復發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及對化療、放療和靶向治療的耐藥［7］。因此，闡明NSCLC的分子發(fā)病機制，對制定有效的干預策略至關(guān)重要。單個miRNA序列能夠調(diào)控眾多靶基因［8］，miRNA通過調(diào)控不同的靶點來驅(qū)動腫瘤發(fā)生和進展，如miR-200、miR-34a在乳腺癌和腦膜瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［9-10］。本研究結(jié)果顯示，miR-203在NSCLC細胞和組織表達下調(diào)，作為一個腫瘤抑制microRNA，通過抑制ABCE1途徑的多個關(guān)鍵組件，抑制肺癌細胞生長和細胞侵襲性和轉(zhuǎn)移。

miR-203是本課題組前期研究中獨立篩選出的與肺癌密切相關(guān)的基因，并被證實具有確切的影響肺癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等行為的功能。本文系統(tǒng)研究miR-203對ABCE1的調(diào)節(jié)，進一步探討肺癌細胞增殖、凋亡的影響及機制，不僅有助于解決肺癌基礎(chǔ)理論的相關(guān)問題，還有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點。已有研究［11］表明，miR-203通過抑制GATA6的表達來降低人類結(jié)腸癌細胞的干細胞特性；在透明細胞腎細胞癌中，miR-203通過調(diào)節(jié)ZEB2參與了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化通路的激活［12］；miR-203在食管癌細胞中是一種腫瘤抑制因子，其表達水平有可能被用作食管癌患者預后的預測指標［13］。以上均提示miR-203的功能依賴于腫瘤細胞。本研究結(jié)果表明，miR-203在NSCLC細胞系和腫瘤組織中的表達明顯降低。這一數(shù)據(jù)提示miR-203在調(diào)控多種信號通路方面發(fā)揮著核心作用，對于肺癌藥物的開發(fā)具有潛在意義。

ABCE1是ATP結(jié)合盒超家族的成員之一，但是缺乏該家族其他轉(zhuǎn)運蛋白所共有的跨膜區(qū)域，因此不參與任何跨膜轉(zhuǎn)運功能。近年來，隨著對ABCE1基因深入的研究，有證據(jù)表明該基因可能與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)［14］。最新的報道［15］顯示，ABCE1對于肺癌化療的敏感性有重要的作用。前期工作中本課題組應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性敲除ABCE1的表達后，發(fā)現(xiàn)其抑制了肺腺癌細胞、小細胞肺癌細胞的增殖及侵襲能力，并誘導細胞凋亡。目前，除了負性調(diào)節(jié)2-5A/ RNase L通路以及參與蛋白翻譯過程［16］，ABCE1基因的機制研究不多，其在腫瘤內(nèi)乃至肺癌內(nèi)的作用機制和細胞通路尚未明確。

綜上，本研究首次篩選出NSCLC組織內(nèi)能夠有效調(diào)節(jié)ABCE1基因的 miR-203，并證實miR-203在肺癌內(nèi)表達的減少降低了對ABCE1基因的負性調(diào)節(jié)，從而促進了肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制了凋亡。miR-203及其調(diào)節(jié)的ABCE1基因很有可能作為新的突破口，為肺癌的診治提供新的思路。