濃縮生長(zhǎng)因子（CGF）對(duì)人根尖牙乳頭干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響*

王景莉 馮保靜

年輕恒牙及未完全發(fā)育牙齒因齲病或牙外傷導(dǎo)致牙髓壞死或根尖周炎，其治療措施包括傳統(tǒng)的根尖屏障術(shù)、根尖誘導(dǎo)成形術(shù)以及近年來(lái)實(shí)施的牙髓血運(yùn)重建，其生物學(xué)基礎(chǔ)是根尖區(qū)組織含有大量前體細(xì)胞。Sonoyama 等[1]首先將這部分處于未分化狀態(tài)的前體細(xì)胞分離培養(yǎng)，并命名為根尖牙乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla,SCAPs），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其具有高增殖率、較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能。研究顯示SCAPs長(zhǎng)期高表達(dá)抗凋亡蛋白及端粒逆轉(zhuǎn)錄酶，且來(lái)源于同一牙齒的SCAPs 較其他牙源性干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、分化能力[1-3]。另外，SCAPs具備更強(qiáng)的抗感染能力，當(dāng)牙髓組織感染將導(dǎo)致牙髓干細(xì)胞失去活力，SCAPs 仍可繼續(xù)保持其活性，這是由于其所處的生長(zhǎng)環(huán)境血運(yùn)側(cè)支循環(huán)較髓腔內(nèi)的牙髓干細(xì)胞更為豐富[4]。SCAPs 作為組織工程中極具潛力的種子細(xì)胞，其出現(xiàn)為牙齒修復(fù)再生及組織重建再生提供了新的思路。

CGF 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型血液來(lái)源的生物支架材料，由靜脈取血后通過(guò)差速離心制作而成[5]。CGF 作為繼富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）、富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）后的新一代血小板濃縮物，其不僅是新一代生物支架材料，富含多種高濃縮的纖維蛋白（fibrous protein）及生長(zhǎng)因子（growth factor），包括血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor,PDGF）、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β（Transferring growth factor-β,TGF-β）、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor,IGF）以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors,FGF）等[6]。研究報(bào)道CGF 既有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，又能促進(jìn)牙齦細(xì)胞增殖、粘附及膠原纖維的合成，加快軟組織愈合[7-8]。另外，CGF 的制備不需要特殊的添加劑，其纖維蛋白的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與天然纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)更加相似，制備后捕獲的多種生長(zhǎng)因子可在后期節(jié)律性緩慢釋放[6,9]，使得CGF 在牙髓損傷修復(fù)及及組織工程再生領(lǐng)域具有廣闊臨床應(yīng)用前景。

目前研究發(fā)現(xiàn)自體CGF 可顯著促進(jìn)SCAPs增殖、遷移及成骨向分化，但患有貧血等血液疾病者其自體CGF 的使用受到了限制，那么異體CGF 是否能夠發(fā)揮同樣的作用尚不明確，為闡明人異體CGF 對(duì)SCAPs 影響的差異，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制取異體CGF，檢測(cè)其對(duì)SCAPs 生物學(xué)特性的影響，為異體CGF的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶細(xì)胞消化液、α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）；CCK-8（DOJINDO，日本）；ALP試劑盒（碧云天，中國(guó)）；紫外線(xiàn)分光光度儀（Eppendorf，德國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar，美國(guó)）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI，美國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；胎牛血清（FBS）；（Hyclone，美國(guó)）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（BIO-TEK，美國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar，美國(guó)）；CD29、CD90、CD105、CD34、CD45（BIOLEGEND，美國(guó)）；牛血清白蛋白（BSA)（Biosharp，中國(guó)）。

1.2 hSCAPs 的分離、培養(yǎng)及鑒定 口腔頜面外科收集12名15-22歲志愿者正畸拔除前磨牙及第三磨牙，要求牙齒完整無(wú)齲壞且根尖未發(fā)育完全，其中6名志愿者同期抽取靜脈血，進(jìn)行自體CGF 膜片制備。拔除牙齒立即放入冰浴PBS 中，超凈臺(tái)內(nèi)反復(fù)沖洗牙齒表面并去除牙齦、牙周膜軟組織，使用手術(shù)刀片分離出根尖牙乳頭組織放入1.5mL EP 管，使用眼科剪將根尖牙乳頭組織塊剪碎至1mm3大小，加入Ⅰ型膠原酶（3mg/mL），輕柔混勻后放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化45min，10min使用移液槍混勻一次，終止消化、離心去上清，細(xì)胞重懸并接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合率達(dá)80%左右時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

流式細(xì)胞術(shù)鑒定：取第3代hSCAP接種于培養(yǎng)瓶，當(dāng)hSCAP融合率達(dá)80%左右，消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液后離心，0.5%牛血清白蛋白（BSA）重懸細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀樣品管中分別加入1mL細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/mL），常溫下孵育細(xì)胞懸液與目標(biāo)抗體（CD29、CD90、CD105、CD34、CD45、IgG）1h，1000r/min離心后去上清，PBS洗脫未結(jié)合抗體，上機(jī)檢測(cè)表面標(biāo)記物。

hSCAPs 成骨向誘導(dǎo)及成脂向誘導(dǎo)培養(yǎng)：當(dāng)根尖牙乳頭干細(xì)胞生長(zhǎng)融合率達(dá)80%左右時(shí)，將完全培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基[9]，定期更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，使用三蒸水洗脫殘留多聚甲醛，參照茜素紅及油紅O染色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察并記錄脂滴及鈣化結(jié)節(jié)形成情況。

1.3 CGF膜片的制備 經(jīng)安陽(yáng)市第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，在口腔頜面外科招募12名15-22歲男性志愿者，要求身體健康，無(wú)系統(tǒng)性疾病，使用真空采血試管采取其中6名志愿者前臂靜脈血，其余6名志愿者拔除前磨牙或第三磨牙，進(jìn)行根尖牙乳頭干細(xì)胞培養(yǎng)。采血管放入離心機(jī)，不間斷差速離心13min，即可得到CGF 纖維蛋白層，此時(shí)可見(jiàn)真空管內(nèi)血液分為三層，中間層即為CGF凝膠。采血管內(nèi)取出CGF凝膠，制備CGF膜，裁剪備用。hSCAPs 患者之外志愿者來(lái)源的CGF 為異體CGF（homogenous CGF,H-CGF）。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將異體CGF膜裁剪至標(biāo)準(zhǔn)膜的1/2 及1/4 大小，并置于96 孔板中，取20μl 濃度為5×105/ml 的細(xì)胞懸液接種于96 孔板不同體積的異體CGF 上，培養(yǎng)箱中靜置2h，待細(xì)胞附著后，補(bǔ)加培養(yǎng)基至l00μl，繼續(xù)培養(yǎng)7d 后，更換為CCK-8 工作液孵育2h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各組在1、3、5、7d時(shí)450nm處吸光度（OD）值。

1.5 ALP 活性檢測(cè) 將異體CGF 置于6 孔板中，狀態(tài)良好的細(xì)胞消化離心，并使用不同的培養(yǎng)基重懸，空白對(duì)照組（Con）使用單純?chǔ)?MEM 重懸細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)組（Osteogenic differentiation Medium,OM）及CGF 組均使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于6 孔板及異體CGF 上培養(yǎng)24h，然后更換為成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)7d、14d，對(duì)照組（Con）更換為不含CGF 膜的成骨誘導(dǎo)液，根據(jù)說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組ALP活性。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)成骨/成牙基因表達(dá) 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)7d，提取細(xì)胞總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，采用Real Time-PCR 檢測(cè)各組ALP、DSPP、BSP、OCN 成骨/成牙相關(guān)基因的表達(dá)，以β-actin 為內(nèi)參基因。Real Time-PCR 反應(yīng)條件及反應(yīng)體系參照說(shuō)明書(shū)操作，引物序列見(jiàn)表1。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列

1.7 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移采用無(wú)血清a-MEM 和完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，不含血清的a-MEM 為空白對(duì)照組（Con），含10%FBS 的a-MEM 為陽(yáng)性對(duì)照組（positive group,PG），含10%FBS 的a-MEM 加CGF 膜片為H-CGF 組，在24 孔板Transwell 小室的下層加入600μL 培養(yǎng)液及異體CGF 膜，取150μL（5×104/ml）細(xì)胞懸液接種于小室，培養(yǎng)24h 后，多聚甲醛固定小室上遷移的細(xì)胞，用小棉簽擦去小室上層為遷移細(xì)胞，1g/L結(jié)晶紫染色液20min，清洗后顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)或方差分析，實(shí)驗(yàn)均各重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 hSCAPs 的培養(yǎng)及鑒定hSCAPs 成骨、成脂向誘導(dǎo)4 周后，茜素紅染色可見(jiàn)成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞可形成大量鈣化結(jié)節(jié)（圖1），而油紅O 染色可見(jiàn)成脂誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴形成（圖2），說(shuō)明hSCAPs具有多向分化潛能。流式結(jié)果顯示干細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD105、CD90、CD29呈陽(yáng)性表達(dá)，而血細(xì)胞標(biāo)記分子CD34、CD45 則呈陰性表達(dá)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面分子表達(dá)特性（圖3）。

2.2 CGF對(duì)hSCAPs增殖能力的影響

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，異體CGF 組（H-CGF）和對(duì)照組在培養(yǎng)hSCAPs 1、3、5、7d 時(shí)，不同濃度的H-CGF 均明顯高于其對(duì)照組的OD值，表明CGF 可提高h(yuǎn)SCAPs 的增殖率（P<0.05)；但不同膜片大小的H-CGF 組間無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05)，提示促進(jìn)hSCAPs 增殖能力的CGF不具有濃度依賴(lài)性（圖4)。

2.3 CGF 對(duì)hSCAPs成骨/成牙能力的影響

成骨誘導(dǎo)組（OM）的ALP 活性在hSCAPs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d、14d 時(shí)均明顯高于空白對(duì)照組（P<0.05)，且H-CGF 組的ALP 活性顯著高于OM 組（P<0.05)，(圖5)。qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示H-CGF 組中成骨基因ALP、DSPP、BSP、OCN mRNA 的表達(dá)均明顯高于OM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，(圖6)。

2.4 CGF 對(duì)hSCAPs遷移能力的影響

Transwell 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組（PG）遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯高于空白對(duì)照組（Con）(P<0.05)，且H-CGF 組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目均明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組（PG）(P<0.05),(圖7)。

3.討論

SCAPs 位于牙根未發(fā)育完全的年輕恒牙及乳牙中，其具有高度增殖能力和成骨/成牙分化能力，在牙根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)將SCAPs復(fù)合培養(yǎng)于羥基磷灰石（HA-TCP）支架材料后植入裸鼠皮下，4-8 周后可形成類(lèi)牙齒樣結(jié)構(gòu)[11]，提示SCAPs 在牙齒修復(fù)再生及組織重建中起著重要作用。

由于CGF 具備更加接近天然結(jié)構(gòu)的纖維網(wǎng)狀支架，并能更好的富集高濃度生長(zhǎng)因子，使得CGF迅速成為研究熱點(diǎn)[12]。此外，CGF 纖維支架中各組生長(zhǎng)因子的釋放更接近組織愈合的自然過(guò)程，在軟、硬組織愈合過(guò)程中的發(fā)揮的作用更強(qiáng)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，CGF 刺激間充質(zhì)干細(xì)胞后，可通過(guò)TGF-β/BMP、Wnt/β-catenin 等通路上調(diào)干細(xì)胞內(nèi)成骨基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞成骨向分化，促進(jìn)骨組織再生[13]。Hong 等[14]發(fā)現(xiàn)，CGF 內(nèi)的細(xì)胞因子可趨化牙髓干細(xì)胞聚集，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，在根尖周炎中炎癥性牙髓的再生中發(fā)揮重要作用。Ding 等臨床研究表明CGF 在牙髓再生治療中可發(fā)揮緩慢釋放細(xì)胞生長(zhǎng)因子和作為細(xì)胞生長(zhǎng)支架的雙重作用，不僅能替代牙髓血運(yùn)重建傳統(tǒng)治療中的血凝塊，還可提高牙髓再生治療的成功率[15]。體外研究顯示自體CGF 可促進(jìn)PDLSC 的增殖、成骨向分化能力[16]，而hSCAP 在牙根的形成和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是根尖誘導(dǎo)成形術(shù)中牙根繼續(xù)發(fā)育的重要細(xì)胞來(lái)源，明確CGF 對(duì)SCAP 生物學(xué)特性的影響對(duì)CGF 在牙組織工程中的應(yīng)用具有重要意義。

本研究選取異體CGF對(duì)hSCAPs進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)hSCAPs 的增殖、遷移及成骨/成牙分化等生物學(xué)特性。CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，異體CGF 在第1、3、5、7d均可明顯促進(jìn)hSCAPs的增殖。此外，本研究發(fā)現(xiàn)異體CGF 對(duì)SCAPs 成骨/成牙向分化具有顯著促進(jìn)作用。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則顯示異體CGF 對(duì)hSCAPs 遷移能力具有明顯促進(jìn)作用。研究表明，制備CGF 過(guò)程中，真空離心管的不同規(guī)格可使最終獲得的CGF 纖維支架具有一定的差異[17]，并且不同志愿者的身體狀況、年齡、性別及生活習(xí)慣等差異較大，則制備出的CGF 在濃度和活性方面也會(huì)產(chǎn)生較大差異[18]；因此，本實(shí)驗(yàn)制備CGF 時(shí)選用18-20歲健康男性志愿者，并采用同一批次靜脈血采集管，以減少年齡、性別差異引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

綜上，CGF 作為繼PRP 和PRF 后的最新一代血小板纖維蛋白濃縮物，其類(lèi)似天然的支架結(jié)構(gòu)可為細(xì)胞提供生長(zhǎng)及增殖的空間，且富含多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子并具有可吸收性生物膜的特性，在牙髓-牙本質(zhì)再生中可發(fā)揮重要作用。本研究顯示異體CGF 可明顯促進(jìn)SCAPs 增殖、遷移能力，增加堿性磷酸酶活性、提高成骨/成牙相關(guān)基因的表達(dá)水平，促進(jìn)成骨/成牙向分化，為異體CGF 在口腔組織工程的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。