蟾酥殼聚糖微球的制備及體外釋藥性研究

劉 莉 李宗云 何世學 趙 越 張春寶

1.河北省衡水市人民醫(yī)院制劑科，河北衡水 053000；2.河北省衡水市人民醫(yī)院臨床藥學科，河北衡水 053000

中華大蟾酥或黑框蟾蜍的干燥分泌物為蟾酥[1-2]，臨床用于調控血壓[3]、調節(jié)免疫力[4]、抗腫瘤等[5-6]。蟾酥作為中藥制劑的常用藥物，包括脂溶性成分和水溶性成分。5-羥色胺和蟾蜍色胺是主要的水溶性成分[7]，脂溶性成分為蟾毒內酯類[8-9]。酯蟾毒配基及華蟾酥毒基為蟾毒內酯的主要成分[10]，因蟾酥配基具有毒性，在臨床上應用時常有中毒及過敏的報道，限制了其應用。緩控釋制劑不僅能更快地達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度、降低給藥次數(shù)，而且能夠給含毒性的中藥制劑在臨床使用上提供不同的研究方向[11]。查閱文獻發(fā)現(xiàn)鮮有把蟾酥制成殼聚糖微球這種新劑型的相關研究，因此本文對蟾酥殼聚糖微球進行研究，并對微球內的水溶性及脂溶性成分進行了相關研究。

微球有增加穩(wěn)定性、提高生物利用率等特點[12-13]。本研究把脫乙酰殼聚糖作為載體，通過乳化-交聯(lián)法來制作蟾酥殼聚糖微球，并觀察研究其在體外的釋藥特性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司，可變波長紫外檢測器)；SQP 電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，精密度：0.01 mg]；KDC-1042 低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)；激光粒度分析儀(歐美克科技有限公司)；RCZ-8AA 智能藥物溶出儀(天津大學精密儀器廠)；UV-2700 紫外分光光度計(島津)。

1.2 藥物與試劑

脫乙酰殼聚糖(脫乙酰度＞90%，玉環(huán)縣海洋生物化學有限公司)；蟾酥(河北康博藥業(yè)有限公司，20150521，經(jīng)河北省衡水市人民醫(yī)院中醫(yī)科肖紅主任鑒定為蟾酥飲片)；華蟾酥毒基對照品(中國食品藥品檢定研究院，110803～200505，純度≥99.6%)；酯蟾毒配基對照品(中國食品藥品檢定研究院，7189306，純度≥98%)；5-羥色胺對照品(中國食品藥品檢定研究院，10015～201706，純度≥98%)；三氯甲烷(萊陽市精細化工廠，20180310)；丙酮(煙臺遠東精細化工廠，20180901)；正丁醇(天津市恒興化學試劑精造有限公司，20181006)；乙腈(美國fisher chemicals，08412，色譜純)；水為高純水。

2 方法與結果

2.1 蟾酥殼聚糖的制備

2.1.1 處方 水相：1%醋酸、1%脫乙酰殼聚糖、蟾酥；油相：液體石蠟；乳化劑：司盤60；固化劑：戊二醛。

2.1.2 制備方法 取殼聚糖1.00 g 溶于99 mL 水中，攪拌均勻，攪拌的同時加入1 mL 冰醋酸，混勻，備用。0.20 g 蟾酥加20 mL 乙醇使溶解，將上述兩種液體混勻。放置過夜，靜止消泡，備用[14-16]。取1.00 g 司盤60加200 mL 液體石蠟，攪拌使其混合均勻。將水相加入油相中，攪拌1 h，攪拌同時加入12 mL 戊二醛，3 h，使固化，高倍顯微鏡下觀察沒有粘連現(xiàn)象。低速離心機下離心10 min，轉速3000 r/min，離心半徑13 cm，取下層，經(jīng)石油醚多次洗滌后，80℃真空干燥箱干燥24 h，收集得到微球。

2.2 鑒別

2.2.1 蟾毒內酯類成分 取相當于0.20 g 的微球，加10 mL 乙醇，加熱回流30 min，放冷，過濾，濾液置于10 mL 量瓶，乙醇稀釋至刻度，為供試品溶液。精密稱取酯蟾毒配基、華蟾酥毒基對照品，稀釋成濃度為1 mg/mL 的溶液，為對照品溶液。吸取供試品、對照品液各8 μL，點于同一硅膠G 板，環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮(4∶3∶3)展開劑中展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，均有2 個斑點且陰性沒有干擾，見圖1A(封三)。

圖1 蟾酥殼聚糖微球的薄層鑒別(見內文第32 頁)

2.2.2 蟾毒色胺類成分 取相當于0.20 g 的微球，加50 mL 水，煎煮3 次，每次1 h，濾過，合并濾液置于100 mL 量瓶中，加水稀至刻度，搖勻，為供試品溶液。吸取供試品、對照品液各8 μL，點于同一硅膠G 板，正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)展開劑中展開，取出，晾干，噴以20%對二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點且陰性沒有干擾，見圖1B(封三)。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件與適用性試驗 Diamonsil(C185 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀(52∶48)，磷酸調pH 為3.0，檢測波長：296 nm，流速：1.00 mL/min，柱溫：40℃；進樣：10 μL[17-19]。見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的華蟾酥毒基對照品1.00 mg、酯蟾毒配基對照品0.90 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，濃度分別為100、90 μg/mL，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取0.25 g 微球，置于圓底燒瓶中，加25 mL 甲醇，稱重。加熱回流1 h，放冷，再次稱重，差值用甲醇補足，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關系考察 標準曲線繪制：分別精密量取華蟾酥毒基或酯蟾毒配基對照品溶液0.10、0.50、1.00、1.50、3.00、5.00 mL，置5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取10 μL，高效液相色譜進行測定。橫坐標為對照品溶液濃度(μg/mL)，縱坐標為峰面積，繪制標準曲線，回歸方程：華蟾酥毒基Y=7367.4X+4026(r=0.9998)，表明在0.02～1.00 μg 內有很好的線性關系；酯蟾毒配基Y=10865X+7175.5(r=0.9997)，表明在0.018～0.900 μg內有很好線性關系。

2.3.5 精密度試驗 取“2.3.2”對照品溶液10 μL，均進樣6 次，按“2.3.1”的色譜條件進行測定，考察精密度。華蟾酥毒基及酯蟾毒配基的相對標準偏差(RSD)分別為0.18%和0.27%。

2.3.6 穩(wěn)定性實驗 將濃度分別為5 μg/mL 華蟾酥毒基、18 μg/mL 酯蟾毒配基的溶液，按“2.3.1”條件于0、2、4、6、12、18、24 h 進樣10 μL，華蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分別為0.44%和0.65%，表明在24 h 內穩(wěn)定。

2.3.7 重復性試驗“2.3.6”相同濃度對照品溶液均取6 份，按“2.3.1”進行測定。華蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分別為2.65%和2.35%，說明該方法有很好的重現(xiàn)性。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知含量的蟾酥粉末10.6 mg，精密稱定9 份，另分別加入相當于含量為80%、100%、120%華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對照品溶液，按“2.3.1”進行測定。求得華蟾酥毒基平均加樣回收率為98.21%，酯蟾毒配基平均加樣回收率為97.18%。均得到很好的回收率，可以作為含量測定。見表1～2。

表1 華蟾酥毒基加樣回收率結果

表2 酯蟾毒配基加樣回收率結果

2.4 微球形態(tài)及粒徑考察

光學顯微鏡觀察其形態(tài)，用激光粒度分析儀測量其粒徑，平均粒徑為9.20 μm。

2.5 蟾毒內酯類含量測定

稱取3 批0.10 g 微球，置于圓底燒瓶中，加50 mL甲醇，稱重?；亓骷訜? h，放冷，再次稱重，差值用甲醇補足，濾過，取1 mL 續(xù)濾液置于20 mL 量瓶中，定容，為供試品溶液，制作3 份按上述高效液相色譜條件進行檢測，測得總載藥量平均值為6.06 mg/g。見表3。

表3 蟾毒內酯類成分的載藥量(mg/g，n=3)

2.6 包封率測定

精密稱取蟾酥殼聚糖微球25 mg，加入10 mL 甲醇，超聲提取，放置過夜后將微球研磨，3000 r/min 離心5 min，取上清液置于10 mL 容量瓶中定容，過微孔濾膜，10 μL 進樣測定含量，計算包封率[20]，微球的平均包封率為73.30%。見表4。

表4 包封率測定結果(n=3)

2.7 吲哚生物堿類含量測定

取微球0.10 g，置入圓底燒瓶中，加50 倍水，回流加熱1 h，提取3 次，冷卻，過濾，取續(xù)濾液，倒入100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度作為供試品溶液[21-22]。制作3 份在波長556 nm 處測定吸光度，平均含量為6.59 mg/g。見表5。

表5 吲哚生物堿類含量(n=3)

2.8 體外溶出度

依據(jù)2020 版藥典[23]，采用漿法測定釋放度，溶出介質為人工胃液和人工腸液[24]。取蟾酥微球和蟾酥原料藥，入透析袋，置于不同的溶出杯中。溫度：(37.0±0.1)℃，轉速：(100±1)r/min，介質量：1000 mL，分別在20、60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 min 時取1 mL，過膜，差值采用人工胃液或人工腸液進行補足，直到達到平衡，見圖3。釋放度實驗說明：與蟾酥原料藥比較，蟾酥殼聚糖微球具有很好的緩釋效果。

圖3 蟾酥在人工腸液及人工胃液中的溶出曲線

3 討論

3.1 殼聚糖微球的制備

造成最后制得的微球載藥量小，可能是由于應用的1%的殼聚糖含量少，大部分是水分。也可能是由于在放置過夜脫泡時蟾酥隨乙醇有部分揮發(fā)或在倒入離心杯時有損失又或者在用石油醚洗滌下層時有損失等；在制做微球的過程中，本研究用乙醇溶解，是因為乙醇較甲醇對人體內的危害性小，毒性小，安全性高。

為提高蟾酥的生物利用度，本研究將蟾酥制成具有緩釋效果的殼聚糖微球，為減小殼聚糖溶液的黏稠度及更易于乳化，在水相中加入了乙醇，加戊二醛目的是防止微球粘連，使其更易固化。

3.2 蟾酥的溶出

對藥物釋放速率產(chǎn)生影響的因素有：微球粒徑大小不同、囊膜的薄厚不同或骨架、制備工藝的不同、藥物自身的劑型等[25-27]。通過上述實驗可以看出殼聚糖微球在人工胃液及人工腸液中有很好的緩釋作用，可減少藥物含量在血液中波動及給藥次數(shù)，為臨床應用提供依據(jù)。

對蟾酥的劑型研究，通過查閱相關文獻為降低蟾酥的毒性，人們把蟾酥制成各種劑型，如：脂質體、自微乳以及β 環(huán)糊精等，但是沒有發(fā)現(xiàn)把蟾酥制成以殼聚糖為載體的微球，因此把蟾酥制成微球，研究蟾酥殼聚糖微球在體外的釋藥特性，為進一步進行體內的動物試驗提供依據(jù)及為最后應用于臨床奠定基礎。