河南省花生白絹病菌群體多樣性及對萎銹靈敏感性研究

李 敏，李 爽，張忠信，杜鵬強，周 琳，董文召

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院/河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應用重點實驗室/河南省綠色農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省作物分子育種研究院/河南省農(nóng)業(yè)科學院 經(jīng)濟作物研究所，河南 鄭州 450002)

花生白絹病是由齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)引起的土傳真菌病害，亦稱莖腐病、腳腐病、南方枯萎病等。該病原菌以菌核和菌絲在土壤中或植株病殘體上越冬，在適宜的條件下，菌絲或萌發(fā)的菌核從花生植株莖基部侵入，導致受侵染植株變黃、枯萎，根莖部變褐、腐爛[1-3]；亦可侵染花生莢果和果仁，影響產(chǎn)量?；ㄉ捉伈≡谑澜绺骰ㄉa(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。近年來，隨著我國花生種植面積的增加，連作重茬及秸稈還田等耕作方式日益普遍，導致花生白絹病在我國各花生產(chǎn)區(qū)發(fā)生危害日趨嚴重、分布區(qū)域逐年擴大，山東、河南和湖北等省[4-10]均有大面積暴發(fā)流行的報道，地塊發(fā)病株率為10%～30%，嚴重地塊達40%以上；發(fā)病田塊減產(chǎn)10%～20%，病重田塊減產(chǎn)50%以上，甚至造成絕收，該病害已成為限制我國花生生產(chǎn)的一個重要因子。

控制花生白絹病菌侵染將是花生生產(chǎn)中持續(xù)面對的問題。雖然作物輪作是病害治理的重要基礎，但由于白絹病菌有500多種寄主植物以及菌核在土壤中可存活3～5 a，極大地限制了采用與非寄主作物輪作或整地時用土深埋受侵染作物殘體等物理和栽培措施[11]。再者，持久的寄主抗性可能是最有效的病害管理手段之一，但目前市面上缺乏抗白絹病的花生品種。盡管有報道稱美國花生田白絹病菌種群對五氯硝基苯、氟酰胺和戊唑醇的敏感性下降[12-13]，但施用化學殺菌劑仍是目前防治花生白絹病最常用的措施。

利用化學防治和生物防治控制花生白絹病菌，必須了解該病原菌的分布和多樣性。菌絲親和群(MCG)是一種廣泛用于研究病原真菌的遺傳多樣性、地理分布、病害流行規(guī)律和病原致病性變異等的重要手段[14-15]。NALIM等[16]和XIE等[17]分別通過MCG分析對美國德克薩斯州和美國南部6州花生白絹病菌田間種群進行了多樣性評估；OKABE等[18]亦采用MCG分析了日本茨城縣花生白絹病菌田間種群的多樣性；CILLIERS等[19]對非洲南部15個地區(qū)7種寄主上分離的121株白絹病菌進行MCG分析的結(jié)果表明，白絹病菌在MCG、寄主和資源分布上存在巨大的變異和聯(lián)系。LE等[11]結(jié)合MCG和核糖體DNA-ITS序列分析，證實了分離自越南中部花生、番茄和芋頭上的103株白絹病菌菌株的菌絲相容性、生長速率和菌核特性等遺傳和表型性狀上表現(xiàn)出多樣性。作為花生種植面積和總產(chǎn)量均居全國前列的河南省，近年來花生白絹病嚴重威脅著省內(nèi)南陽、駐馬店、商丘、周口、新鄉(xiāng)等主產(chǎn)區(qū)的花生生產(chǎn)。但目前關于河南省花生白絹病菌群體多樣性及分布尚缺乏系統(tǒng)研究。截至2020年12月21日，我國登記用于防治花生白絹病的化學殺菌劑僅有7種(http://www.chinapesticide.gov.cn /)，其中萎銹靈(Carboxin)是一種內(nèi)吸性較強的琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑(SDHIs)，國外亦早已登記用于防治由齊整小核菌引起的多種植物白絹病[2,20-21]。由于其作用靶標單一，有關萎銹靈及結(jié)構(gòu)相似化合物的抗藥性在多種致病真菌，如灰霉病菌(Botrytiscinerea)、瓜類白粉病菌(Podosphaeraxanthii)和西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)[22-24]等上已有報道。但花生白絹病菌對萎銹靈的敏感性變化在我國尚未見研究報道。因此，在對河南省5個花生主產(chǎn)區(qū)花生白絹病系統(tǒng)調(diào)查的基礎上，對采集的28株代表性菌株進行形態(tài)學特征研究和MCG分析，測定萎銹靈對28株菌株的毒力，旨在明確河南省主要花生產(chǎn)區(qū)白絹病菌群體的多樣性、分布及對萎銹靈的敏感性，為科學制定和成功實施花生白絹病的生物防控和化學防控策略提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。

試劑與儀器：95%萎銹靈(Carboxin)，廣西田園生化有限公司生產(chǎn)；二甲基亞砜(分析純)，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；吐溫-80(分析純)，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；RXZ型智能人工氣候箱，寧波江南儀器廠生產(chǎn)；GXZ型智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠生產(chǎn)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；ME104E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；游標卡尺，香港杭泰(國際)集團有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間發(fā)病率調(diào)查和菌株采集 2019年7—8月，在河南省南陽、駐馬店、商丘、鄭州和新鄉(xiāng)5個花生主產(chǎn)區(qū)，隨機選取23塊花生田對花生白絹病的發(fā)病率進行調(diào)查。每個田塊之間至少相隔10 km上。每個田塊采用五點取樣法進行調(diào)查，每點調(diào)查50株，記錄病株數(shù)，并計算發(fā)病率。發(fā)病率=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。在23個田塊中，每個病株上的菌核視為1份樣本，每個田塊均采集15份樣本，并將其分別放于塑料袋中，帶回實驗室進行菌株分離。

1.2.2 菌株的分離和保存 將每份菌核樣本先用30%次氯酸鈉溶液浸泡30 s，再用75%乙醇浸泡30 s，之后用無菌水沖洗3遍，最后用無菌濾紙吸干菌核表面的水分后轉(zhuǎn)接到PDA平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。2 d后挑取單菌核萌發(fā)的單菌絲進行純化培養(yǎng)，此過程重復3次。收集已純化菌株產(chǎn)生的菌核，一份置于滅菌的2 mL 離心管中于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；另一份置于滅菌?0%甘油管中于-80 ℃長期保存。

1.2.3 形態(tài)學特征觀察 將已活化的28株花生白絹病菌菌株分別置于PDA平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，2 d后，在菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，轉(zhuǎn)接于另一PDA平板(直徑90 mm)中央，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，用十字交叉法測量菌株的菌落直徑，并計算每株菌株的菌絲生長速率。菌落直徑測量后，各PDA平板繼續(xù)置于相同條件下培養(yǎng)，期間觀察并記錄菌落特征。28 d后，記錄每個培養(yǎng)皿中的菌核數(shù)量，收集每個PDA平板中的所有菌核，置于30 ℃培養(yǎng)箱中風干24 h后，隨機抽取20個成熟菌核，用游標卡尺測量菌核直徑；用電子天平稱量每個平板中所有菌核的總干質(zhì)量，并根據(jù)每個平板中菌核的數(shù)量計算單個菌核的干質(zhì)量。每株菌株設置3個重復。

1.2.4 MCG測定及其多樣性分析 MCG測定參照XIE等[17]的方法，略作修改：將所有菌株的菌核置于PDA平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗活化，2～3 d后，在菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，轉(zhuǎn)接到PDA平板(直徑90 mm)中。每個PDA平板中包含2株菌株共3個菌餅，其中，1株菌株轉(zhuǎn)接2個菌餅作為親和對照，另1株菌株轉(zhuǎn)接1個菌餅，菌餅之間距離為4～5 cm。轉(zhuǎn)接后的PDA平板放置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，14 d后觀察并記錄各PDA平板上菌株間菌絲交匯處的反應情況。當2株配對菌株的菌絲交匯處相互融合，則記為親和，并被劃分為相同的親和群；當2株配對菌株的菌絲交匯處產(chǎn)生1條明顯的壞死帶或空白帶時，則記為不親和，并被劃分為不同的親和群。本試驗中，28株花生白絹病菌菌株在所有可能的情況下兩兩組合進行配對，每個配對重復3次。

花生白絹病菌MCG的多樣性水平高低以香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H)來表示，香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)是考慮到個體數(shù)量及種類數(shù)量的一個多樣性指數(shù)，其計算公式為：H=-∑[pi×lnpi]，pi為第i個MCG類群中各菌株所占的頻率，香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)的數(shù)值越大，代表多樣性水平越高[25]。

1.2.5 菌株對萎銹靈的敏感性測定 采用菌絲生長速率抑制法[26]測定花生白絹病菌對萎銹靈的敏感性。稱取一定量的95%萎銹靈原藥溶于少量二甲亞砜中，再用含2%吐溫-80的無菌水配制成100 mg/L的母液，并稀釋成系列濃度的藥液，使其中的二甲亞砜和吐溫-80的終濃度分別控制在6%和2%。分別取1 mL藥液和9 mL PDA培養(yǎng)基于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中混勻，制成終質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5和0.031 25 mg/L的含藥PDA平板。將各供試菌株的菌核置于PDA平板上于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗活化，2～3 d后，在菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接于含有萎銹靈系列質(zhì)量濃度的PDA平板上，以含0.6%二甲亞砜和0.2%吐溫-80的無藥PDA平板為相應的溶劑對照，每處理3次重復。置于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，3 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，并根據(jù)概率值分析法求得毒力回歸方程和有效中濃度(EC50值)。菌絲生長抑制率=[(對照菌落直徑-菌餅直徑)-(處理菌落直徑-菌餅直徑)]/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，應用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗，利用Pearson相關系數(shù)法進行相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病率和代表性菌株

通過對5個花生主產(chǎn)區(qū)田間隨機調(diào)查(圖1)，發(fā)現(xiàn)被調(diào)查的23個田塊中花生白絹病均有發(fā)生。其中，2個田塊(5和18)的發(fā)病率分別高達50.4%和47.2%；10個田塊的發(fā)病率為10.4%～28.4%；其余11個田塊的發(fā)病率相對較低，介于3.6%～8.8%。此外，還發(fā)現(xiàn)13個春播花生田塊中白絹病的發(fā)病率均高于10個夏播花生地塊。從河南省5個花生主產(chǎn)區(qū)采集的345份樣本中成功分離到253株花生白絹病菌株，并分別從5個花生主產(chǎn)區(qū)隨機選取其中的28株作為代表性菌株進行MCG分析和形態(tài)學特征研究(表1)。

表1 河南省23個采樣田塊28株花生白絹病菌株信息Tab.1 Information on the 28 isolates of Sclerotium rolfsii from different peanut fields in Henan Province

2.2 形態(tài)學特征

2.2.1 菌落特征 對28株花生白絹病菌菌株的菌落特征觀察結(jié)果表明，所有的菌株均產(chǎn)生白色的菌絲和形成褐色或深褐色的菌核，但這些菌株的菌核在PDA平板上的分布存在差異，其中，8株菌株產(chǎn)生的菌核分布在PDA平板的邊緣(圖2a)，其余20株菌株產(chǎn)生的菌核則隨機分布在PDA平板上(圖2b)。

2.2.2 菌絲生長速率 從表2可以看出，花生白絹病菌不同菌株的菌絲生長速率存在差異。28株菌株的菌絲生長速率在0.55～1.31 mm/h，其中采自南陽的菌株NYXYWJ-4菌絲生長速率最小(0.55 mm/h)，而采自新鄉(xiāng)的菌株XXYYJZ-3菌絲生長速率最大(1.31 mm/h)。對于不同采樣地的菌株來說(因鄭州和駐馬店均只有2株菌株，故未做比較)，南陽、商丘和新鄉(xiāng)的菌株在菌絲生長速率上沒有顯著差異(表3)。

表2 不同采樣地的28株花生白絹病菌菌株的表型特征

2.2.3 菌核特征 在離體條件下，28個花生白絹病菌菌株的菌核干質(zhì)量、菌核直徑和菌核數(shù)量均存在差異，菌核干質(zhì)量為0.50～2.04 mg，菌核直徑為0.91～1.47 mm，每皿菌核數(shù)量為25～186個(表2)。分析不同采樣地的菌株可知(因鄭州和駐馬店均只有2個菌株，故未做比較)，南陽、商丘和新鄉(xiāng)的菌株在菌核數(shù)量上不存在顯著差異；新鄉(xiāng)和商丘的菌株菌核干質(zhì)量明顯比南陽的大；南陽、新鄉(xiāng)和商丘菌株的菌核直徑存在顯著差異(表3)。

表3 河南省不同采樣地花生白絹病菌的形態(tài)學特征Tab.3 Morphological characteristics of Sclerotium rolfsii from different locations in Henan Province

2.3 菌株的菌絲生長速率、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量、菌核直徑的相關性分析

對28株菌株的菌絲生長速率、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量、菌核直徑進行Pearson相關性分析的結(jié)果(表4)表明，菌絲生長速率與菌核數(shù)量(r=0.097，P>0.01)沒有相關性，而菌絲生長速率與菌核干質(zhì)量(r=0.350，P>0.01)、菌核直徑(r=0.219，P>0.01)呈正相關，但沒有達到顯著水平；菌核數(shù)量與菌核干質(zhì)量(r=-0.623，P<0.01)、菌核直徑(r=-0.648，P<0.01)呈顯著負相關；菌核干質(zhì)量與菌核直徑(r=0.937，P<0.01)呈顯著正相關。

表4 28株花生白絹病菌的菌絲生長速率、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量及菌核直徑的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of mycelial growth rate,number,dry weight,diameter of sclerotia among 28 Sclerotium rolfsii isolates from peanut

2.4 菌株的MCG及其多樣性分析

根據(jù)2株配對菌株間菌絲交匯處的反應，28株花生白絹病菌菌株共劃分為5個MCG(表5)，并隨機命名為MCG1、MCG2、MCG3、MCG4、MCG5。5個MCG的頻率和地理分布存在差異。MCG1是最大的親和群，包含15株菌株，占總菌株數(shù)的53.57%，分布于除駐馬店外的所有采樣地；MCG2的菌株數(shù)量僅次于MCG1，包含9株菌株，占總菌株數(shù)的32.14%，分布于南陽、新鄉(xiāng)和駐馬店3個采樣地；其余3個MCG占總菌株數(shù)的14.29%，其中MCG3、MCG4、MCG5分別包含2、1、1株菌株，其分布均局限于1個采樣地，分別為南陽、鄭州和駐馬店。在這5個MCG中，僅來自商丘的菌株被劃分到1個親和群中，而其他采樣地的菌株分別被劃分到不同的親和群中，說明除商丘外，其他采樣地出現(xiàn)的MCG與菌株的地理來源無相關性。

表5 28株花生白絹病菌菌株的MCG及其多樣性指數(shù)Tab.5 Mycelial compatibility groups and MCGs-related diversity index of 28 Sclerotium rolfsii isolates from peanut

菌株的MCG多樣性分析結(jié)果表明(表5)，28株花生白絹病菌菌株的香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H)為1.13。其中，來自商丘的菌株H為0，來自南陽的菌株H為0.98，來自新鄉(xiāng)的菌株H為0.41，來自鄭州和駐馬店的H均為0.69，說明這5個采樣地花生白絹病菌MCG的多樣性水平不一致。

2.5 28株菌株對萎銹靈的敏感性

采用菌絲生長速率抑制法測定了28株花生白絹病菌株對萎銹靈的敏感性(表 6)，其中最大值(0.299 0 mg/L)是最小值(0.114 4 mg/L)的2.61倍，平均EC50值為0.182 8 mg/L。上述結(jié)果表明，28株花生白絹病菌株對萎銹靈均表現(xiàn)為敏感，且不同菌株對萎銹靈的敏感性存在一定的差異。

表6 28株花生白絹病菌菌株對萎銹靈的敏感性Tab.6 Sensitivity of 28 Sclerotium rolfsii isolates from peanut to carboxin

續(xù)表6 28株花生白絹病菌菌株對萎銹靈的敏感性Tab.6(Continued) Sensitivity of 28 Sclerotium rolfsii isolates from peanut to carboxin

分析不同采樣地的花生白絹病菌對萎銹靈的敏感性可知，不同地區(qū)菌株的EC50平均值間存在差異，但未達到顯著水平(表7)。其中，鄭州的菌株最敏感，EC50平均值為0.144 7 mg/L，而駐馬店的菌株最不敏感，EC50平均值為0.206 7 mg/L，后者EC50平均值是前者的1.43倍。

表7 河南省不同采樣地花生白絹病菌菌株對萎銹靈的敏感性比較Tab.7 Comparison of sensitivity of Sclerotium rolfsii to carboxin from different locations in Henan Province

從敏感性頻率分布圖(圖3)可以看出，供試花生白絹病菌對萎銹靈的敏感性分布呈單側(cè)峰曲線分布，說明供試菌株中沒有出現(xiàn)敏感性下降的群體。

3 結(jié)論與討論

齊整小核菌作為花生白絹病的致病因子，了解花生田中齊整小核菌群體多樣性和流行病學的基本知識，有助于制定和采取有效的防治措施對花生白絹病進行可持續(xù)性治理。本課題組(河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院花生病蟲害課題組)于2019年對河南省5個花生主產(chǎn)區(qū)23個花生田塊的實地調(diào)查顯示，花生白絹病的發(fā)病率為3.6%～50.4%，與我國其他多個省份的報道基本一致[5-8]。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，夏播花生田塊白絹病的發(fā)病率均低于春播花生田塊，且前茬作物為小麥和大蒜的田塊發(fā)病率較低。ZEIDEN等[27]和MINTON等[28]也報道了花生與大蒜、小麥輪作可降低花生白絹病的發(fā)病率。但也有報道齊整小核菌可侵染小麥，引起麥苗猝倒、腐爛，不能作為花生輪作作物[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，河南省不同采樣地的28株花生白絹病菌株在菌落特征、菌絲生長速率及菌核的數(shù)量、干質(zhì)量和直徑等形態(tài)學特征上存在著一定差異，說明河南省5個花生主產(chǎn)區(qū)的花生白絹病菌菌株具有多樣性，這與宋萬朵等[30]對我國12個省市的39株花生白絹病菌株形態(tài)學研究結(jié)果一致。LE等[11]研究發(fā)現(xiàn)，越南偏遠地區(qū)的3個花生白絹病菌菌株產(chǎn)生的菌核顯著大于其他地區(qū)菌株產(chǎn)生的菌核，本研究也發(fā)現(xiàn)，新鄉(xiāng)菌株的菌核顯著大于其他地區(qū)菌株的菌核，推測花生白絹病菌的菌核大小可能與地理位置有關。此外，本研究對28株菌株的菌絲生長速率、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量和菌核直徑兩兩進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)菌株的菌核數(shù)量、干質(zhì)量和直徑之間存在顯著相關性，證實和擴展了前人對齊整小核菌形態(tài)學特征中各測量值間關系的研究結(jié)果[7,31]。

早期關于白絹病菌MCG分析的研究表明，在一個特定的寄主或在一個有限的地理區(qū)域內(nèi)白絹病菌群體能夠被劃分為不同的MCG[17,31-32]；來自同一MCG的菌株在遺傳上比來自不同親和群的菌株更為相似[19,33-34]。本研究中,采自河南省5個花生主產(chǎn)區(qū)的28株花生白絹病菌株被劃分為5個MCG，進一步表明這28株菌株間存在多樣性。其中，最大的MCG1中菌株分布于除駐馬店外的其他4個采樣地，表明MCG1中的菌株可能通過種子調(diào)運、雨水、昆蟲和農(nóng)事操作等方式在河南省多數(shù)花生產(chǎn)區(qū)已廣泛傳播，REMESAL等[32]對甜菜白絹病菌MCG的研究也得出了類似的結(jié)論。宋萬朵等[30]研究發(fā)現(xiàn)，駐馬店的7株花生白絹病菌株被劃分為6個親和群，而本研究中采自駐馬店的2株菌株被劃分為2個親和群，推測該區(qū)花生白絹病菌群體多樣性水平較高。值得注意的是，本研究中還發(fā)現(xiàn)MCG與菌株的地理位置似乎沒有相關性，與前人的研究結(jié)果一致[19,30]?；贛CG的測定結(jié)果，香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H)被廣泛用于測定病原菌群體多樣性水平的高低[25,31,35]。本研究中28株花生白絹病菌株總的香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H)為1.13，與前人的研究結(jié)果相比[31-32,35]，其多樣性水平相對較低。

本研究結(jié)果表明，采自河南省5個花生主產(chǎn)區(qū)的28株白絹病菌株對SDHIs殺菌劑萎銹靈均很敏感，且不同菌株間敏感性無顯著差異，28株供試菌株對萎銹靈的敏感性呈單側(cè)峰曲線分布，未檢測到有敏感性明顯分化的群體存在，該結(jié)果能反映出田間自然情況下病原菌對SDHIs類殺菌劑的敏感性特征。但由于SDHIs殺菌劑靶標的作用位點單一，已被殺菌劑抗性行動委員會(Fungicides Resistance Action Committee)歸為中等至高抗性風險[36]，且FRANKE等[12]報道了美國喬治亞州花生白絹病菌對SDHIs類殺菌劑氟酰胺已產(chǎn)生抗藥性，因此，有必要進一步加強河南省花生白絹病菌對萎銹靈的抗性監(jiān)測、風險評估及治理措施研究。