植物生長調(diào)節(jié)劑及培養(yǎng)條件對大花序桉試管苗玻璃化的影響

李佳蔓, 黃 振, 陳 炙, 曹昆彬, 吳玉丹, 郭洪英

(四川省林業(yè)科學(xué)研究院， 四川 成都 610081)

0 引言

【研究意義】大花序桉(EucalyptuscloezianaF. Muell)是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucaly-ptusL Her)的一個種，天然分布于昆士蘭州。大花序桉是速生珍貴用材樹種，木材呈黃褐色，質(zhì)地緊密，沉重堅固，是很好的室內(nèi)裝飾材料，適合培育大徑材[1]。四川省于1982年開始引種大花序桉，其表現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿?，被列為四川最具發(fā)展?jié)摿Φ蔫駱渲籟2-3]。但在其組織培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)玻璃化，從而影響大規(guī)模育苗及其應(yīng)用效果。因此探明大花序桉試管苗玻璃化的影響機制，對促進大花序桉大規(guī)模育苗及提升應(yīng)用效果具有重要的現(xiàn)實意義。【前人研究進展】大花序桉屬于異花蜂蟲媒樹種，種間種內(nèi)均易雜交，子代遺傳分化較大[4]，制約了其大規(guī)模推廣與發(fā)展，采用組織培養(yǎng)能很好解決此難題[5]。玻璃化是植物組織培養(yǎng)過程中一種常見的生理病變，玻璃化的試管苗其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)極性化合物水平較高，細胞持水力差，出現(xiàn)異形，已玻璃化的試管苗無法進行正常的生根和移栽，造成育苗過程中人力、物力、財力的巨大浪費，阻礙了工廠化育苗[6]?！狙芯壳腥朦c】增殖過程中試管苗玻璃化是限制大花序桉通過組織培養(yǎng)進行規(guī)?；a(chǎn)的一大難題。對于玻璃化苗產(chǎn)生的原因，目前尚未達成統(tǒng)一定論。多數(shù)學(xué)者認為，試管苗玻璃化是植物離體條件下脅迫環(huán)境引發(fā)的生理失調(diào)，是對脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)[7-8]。【擬解決的關(guān)鍵問題】探索大花序桉組織培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象的部分誘發(fā)因子，提出應(yīng)對措施，為解決大花序桉組織培養(yǎng)過程中玻璃化嚴重的難題提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為四川省林業(yè)科學(xué)研究院提供的川林-09大花序桉健壯試管苗。

1.2 試驗方法

采用單因素試驗設(shè)計和正交試驗設(shè)計，研究植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA和IBA)及培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基添加劑與培養(yǎng)條件)對大花序桉試管苗玻璃化的影響。

1.2.1 單因素試驗 以改良的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6個單因素試驗，6-BA(濃度0.1～0.5 mg/L)、NAA(濃度0.01～0.2 mg/L)、IBA(濃度0.05～0.25 mg/L)、蔗糖(濃度10～35 g/L)、光照時間(6～24 h/d)、培養(yǎng)溫度(16～28℃)，具體因素水平設(shè)置見表1，以篩選出大花序桉增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基組合及最適培養(yǎng)條件。

1.2.2 正交試驗 對6-BA、NAA、IBA和蔗糖4種培養(yǎng)基添加劑進行L9(3)4正交試驗設(shè)計，每個因素設(shè)置3個水平，共9個處理(表2)，篩選大花序桉組織培養(yǎng)最佳激素配比及碳源濃度。

表2 4種培養(yǎng)基添加劑對大花序桉玻璃化影響的L9(3)4正交試驗設(shè)計

1.2.3 繼代培養(yǎng) 如無特殊說明，各處理附加6-BA 0.25 mg/L、NAA 0.1 mg/L、IBA 0.15 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉膠6 g/L，全光譜光照強度2 500～4 000 lx，每天光照10 h。每個處理接種9瓶，每瓶12個芽，試驗重復(fù)3次。30 d繼代1次，連續(xù)培養(yǎng)3代，觀察和統(tǒng)計試管苗的生長狀況。

玻璃化判斷標準：葉片、葉柄、嫩梢、莖呈透明或半透明的水漬狀，芽苗腫狀失綠，葉片褶皺呈縱向卷伸、脆弱易碎；有效試管苗判斷標準：單株苗高>1.5 cm，莖桿基部>0.8 mm，2對以上葉，1葉心，葉片深綠，莖桿有一定木質(zhì)化程度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 20進行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計分析有效增殖系數(shù)和玻璃化率。

有效增殖系數(shù)=有效試管苗總數(shù)/接種試管苗數(shù)

玻璃化率=(玻璃化的試管苗數(shù)/試管苗總數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度大花序桉的玻璃化率

從表3看出，當其他培養(yǎng)條件不變時，6-BA、NAA和IBA不同濃度對大花序桉試管苗玻璃化的影響不同。

表3 不同濃度6-BA、NAA和IBA處理下大花序桉試管苗的有效增殖、玻璃化率及試管苗高度

2.1.1 6-BA 培養(yǎng)基中6-BA濃度與試管苗玻璃化率密切相關(guān)。6-BA濃度在0～0.3 mg/L時，隨濃度升高，大花序桉試管苗玻璃化率隨之升高，但均在較低水平(5%以下)；當濃度達0.4 mg/L時，玻璃化率顯著提高，極顯著大于濃度在0.3 mg/L及以下的玻璃化率。當濃度≤0.3 mg/L時，有效增殖系數(shù)隨濃度的增大而增大，且各處理間差異極顯著；當濃度為0.3 mg/L時，有效增殖系數(shù)為3.58；濃度>0.3 mg/L時，由于玻璃化率增高，有效增殖系數(shù)降低。有效試管苗平均高度隨6-BA濃度升高呈先增后降趨勢，當濃度在0.2 mg/L時，有效試管苗平均高度最高，達1.85 cm。表明，大花序桉試管苗在6-BA濃度為0.3 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不但有利于增殖培養(yǎng)，其玻璃化率也得到有效控制。

2.1.2 NAA 隨著NAA濃度增加，各處理大花序桉試管苗有效增殖系數(shù)和玻璃化率均不存在顯著性差異。但各處理間平均有效試管苗高度存在極顯著差異，濃度≤0.05 mg/L處理的有效試管苗高度極顯著小于濃度≥0.1 mg/L處理。因此推測，培養(yǎng)基中NAA濃度不是導(dǎo)致大花序桉試管苗玻璃化的主要因子，但是NAA對大花序桉試管苗生長作用顯著，NAA濃度為0.1～0.2 mg/L時有利于大花序桉生長。

2.1.3 IBA 隨著IBA濃度增加，各處理間大花序桉試管苗的有效增殖系數(shù)、玻璃化率和有效芽高度均不存在顯著性差異。因此推測，培養(yǎng)基中IBA濃度不是導(dǎo)致大花序桉試管苗玻璃化的主要因子，但與其他植物生長調(diào)節(jié)劑共同參與植物的生命活動，彼此間相互協(xié)調(diào)，不可或缺。

2.2 不同培養(yǎng)基添加劑及培養(yǎng)條件大花序桉的玻璃化率

從表4看出，當其他培養(yǎng)條件不變時，不同蔗糖濃度、光照時間和溫度對大花序桉試管苗玻璃化的影響不同。

表4 不同蔗糖濃度、光照時間和溫度處理大花序桉試管苗的玻璃化

2.2.1 蔗糖濃度 健壯試管苗接種于附加不同濃度的蔗糖的培養(yǎng)基中，累積培養(yǎng)3代，大花序桉試管苗玻璃化率隨著蔗糖濃度的升高而降低，當蔗糖濃度為15 g/L和20 g/L時，玻璃化率分別為23.07%和12.63%；當蔗糖濃度≥25 g/L時，各處理間玻璃化率均在7%以下，且差異不顯著。有效增殖系數(shù)和試管苗高度隨蔗糖濃度的增加呈先增后降趨勢，當蔗糖濃度為25～30 g/L時，有效增殖系數(shù)>3，有效試管苗高度>2.1 cm，有效增殖系數(shù)和有效試管苗高度均高于其他處理。表明，蔗糖濃度為25～30 g/L時，有利于大花序桉的增殖培養(yǎng)，玻璃化率低，試管苗生長迅速且苗體健壯。

2.2.2 光照時間 試管苗玻璃化率隨光照時間的增加呈降低趨勢。當光照時間為6 h/d時，玻璃化率高達28.23%；當光照時間為8 h/d時，玻璃化率降低為15.4%；當光照時間≥10 h/d時，玻璃化率<5%。大花序桉有效試管苗高度隨光照時間增加呈減小趨勢。當光照時間為6 h/d和8 h/d時，有效試管苗高度為1.87 cm和1.73 cm，此時試管苗較嫩，偏黃；當光照時間為10 h/d和12 h/d時，有效試管苗高度分別為1.75 cm和1.73 cm，且苗健壯；當光照時間為15 h/d和24 h/d時，有效試管苗高度降低，且苗體木質(zhì)化程度過高，葉片邊緣有少量愈傷。因此，大花序桉比較適宜的光照時間為10～12 h/d。

2.2.3 溫度 培養(yǎng)溫度對大花序桉試管苗玻璃化率存在顯著影響，溫度越高，玻璃化率越高；降低培養(yǎng)溫度(16℃)，玻璃化率低，同時試管苗的增殖和苗高生長也受到極顯著影響；當溫度為20～25℃時，玻璃化率5%以下，有效增殖系數(shù)3.15以上，此時，有效試管苗平均高度>1.70 cm；當溫度升高(28℃)，試管苗生長較快，木質(zhì)化程度降低，玻璃化現(xiàn)象加劇。因此，選擇在20～25℃的環(huán)境對大花序桉進行繼代培養(yǎng)。

2.3 大花序桉預(yù)防玻璃化的最佳激素組合選擇

從表5看出，不同激素和蔗糖組合對大花序桉玻璃化率和有效增殖系數(shù)的影響均存

表5 4種培養(yǎng)基添加劑對大花序桉玻璃化影響的L9(3)4正交試驗結(jié)果

在差異，且達到極顯著水平。極差分析結(jié)果表明，大花序桉玻璃化率和有效增殖系數(shù)影響因子的主次順序均為A>D>C>B，即6-BA >蔗糖>IBA>NAA。增殖系數(shù)越高越好，因此K值越大越好；玻璃化率越低越好，因此K值越小越好，故預(yù)防試管苗玻璃化較優(yōu)培養(yǎng)基配方為A1B2C3D3，較優(yōu)增殖培養(yǎng)基配方為A2B1C3D2。

2.4 預(yù)防大花序桉玻璃化的最佳激素組合

對篩選出的預(yù)防試管苗玻璃化和增殖培養(yǎng)較優(yōu)的培養(yǎng)基配方A1B2C3D3和A2B1C3D2進行驗證試驗，結(jié)果(表6)顯示，大花序桉試管苗在A1B2C3D3培養(yǎng)基中有效增殖系數(shù)2.92，玻璃化率1.37%，平均有效試管苗高1.52 cm，該培養(yǎng)基條件下，雖試管苗玻璃化率低，但葉片深綠、莖段纖細、節(jié)間短、木質(zhì)化程度較高，不利于后期生根。試管苗在A2B1C3D2培養(yǎng)基中有效增殖系數(shù)為3.54，玻璃化率4.87%，平均有效試管苗高度1.68 cm，該培養(yǎng)基條件下，試管苗葉片鮮綠、莖段健壯、木質(zhì)化程度適中，因此大花序桉較優(yōu)增殖培養(yǎng)基配方為改良MS培養(yǎng)基中附加0.3mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、0.15 mg/L IBA、30 g/L蔗糖、6 g/L卡拉膠。由于高濃度蔗糖使試管苗高生長受到抑制，故選擇培養(yǎng)基A2B1C3D2為大花序桉試管苗增殖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基條件下，大花序桉有效增殖系數(shù)高，玻璃化率在合理范圍內(nèi)。

表6 較優(yōu)培養(yǎng)基配方A1B2C3D3和A2B1C3D2培養(yǎng)大花序桉的有效增殖系數(shù)和玻璃化率

3 討論

引起植物組織培養(yǎng)玻璃化的因子主要集中在植物激素、碳源、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)材料等。針對此難題，目前的解決措施是盡可能采取有益且肯定無害的預(yù)防措施，必要時進行個別因子的平衡劑量試驗[9]。細胞分裂素6-BA在組織培養(yǎng)中的主要作用是促進細胞分裂擴大，誘導(dǎo)芽分化。外源細胞分裂素易導(dǎo)致玻璃化，細胞分裂素濃度與玻璃化率成正相關(guān)[10]。王愛芝等[11]在花楸增殖培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致花楸玻璃化的主要原因是細胞分裂素濃度過高或細胞分裂素與生長素比例過高。趙佐敏[12]在非洲菊組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，材料在6-BA濃度為2～4 mg/L的培養(yǎng)基中幾乎無玻璃化苗發(fā)生，隨著6-BA濃度升高，玻璃化率逐漸升高；也有學(xué)者認為，相同代數(shù)的紅葉石楠試管苗玻璃化苗發(fā)生率隨6-BA濃度增加而增加，且在6-BA小于1.0 mg/L時，玻璃化苗發(fā)生率和培養(yǎng)代數(shù)之間呈負相關(guān)[13]。本研究中，大花序桉玻璃化率符合上述規(guī)律，推測6-BA濃度是影響大花序桉試管苗玻璃化的一個關(guān)鍵因子。

蔗糖作為培養(yǎng)基中常用碳源，不僅能提供能量，還可調(diào)節(jié)滲透壓，對培養(yǎng)物的營養(yǎng)狀況和細胞分化有一定影響。適當提高培養(yǎng)基中蔗糖含量，能降低培養(yǎng)基滲透勢，減少試管苗在培養(yǎng)基中可獲取的水分，因此蔗糖濃度與玻璃化呈負相關(guān)[14]。何芳蘭等[15]在高山杜鵑組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，高山杜鵑的增值系數(shù)和有效苗高度隨蔗糖濃度增大呈先增大后減小趨勢，玻璃化率則呈降低趨勢。馬劑民[16]研究認為，適當增加培養(yǎng)基蔗糖含量，可有效克服巨桉組培過程中玻璃化現(xiàn)象。本研究中，蔗糖濃度從15～40 g/L，有效增殖系數(shù)先升高后降低，玻璃化率逐漸降低，有效苗高度先升高后降低，結(jié)果符合以上規(guī)律。成細華等[17]在結(jié)球白菜組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高濃度蔗糖不僅不能抑制玻璃化現(xiàn)象，還抑制試管苗分化，說明采用提高培養(yǎng)基滲透壓的方法來抑制試管苗玻璃化并非適用所有對象。

光照和溫度對試管苗生長有極其重要作用。光是影響葉綠素形成的主要條件，適當增加光照強度和作用時間有利于葉綠體光合作用合成更多有機物，有利于細胞壁、細胞器形態(tài)構(gòu)建等[18-19]。研究中，大花序桉試管苗每天在強度為2 500～4 000 lx光照下培養(yǎng)10～12 h，其玻璃化率極顯著低于每天在相同光照強度下培養(yǎng)6～8 h，說明適當延長光照時間，對預(yù)防大花序桉玻璃化率有顯著作用。另外，植物體本身就是一個化學(xué)反應(yīng)的容器，植物生長速度隨溫度的反應(yīng)曲線實際就是酶與溫度的反應(yīng)曲線，反應(yīng)發(fā)生的快慢取決于酶的活性。不同植物組織培養(yǎng)的最適溫度不同，溫度過低，光合作用產(chǎn)物被轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)化的速度變慢，表現(xiàn)為植物生長緩慢，溫度過高，植物體內(nèi)累積物減少，葉綠素含量較少，木質(zhì)素不能正常生長等，因此培養(yǎng)材料長時間處于偏高的環(huán)境里更易導(dǎo)致玻璃化苗出現(xiàn)[9, 20]。本研究中，當材料在20～25℃環(huán)境下培養(yǎng)時，玻璃化率得到有效控制，但當溫度上升至28℃時，玻璃化率顯著升高。

不少學(xué)者還將不同的凝固劑納入玻璃化影響因子研究范疇。魏琴等[21]研究認為，瓊脂濃度低，培養(yǎng)基中含水量過大，導(dǎo)致培養(yǎng)瓶中濕度過大，從而致組培苗容易玻璃化；瓊脂濃度過高，培養(yǎng)基襯質(zhì)勢過低，造成細胞吸水阻遏，降低玻璃化率。任東植等[22]認為，凝固劑濃度與組培苗玻璃化的發(fā)生率沒有必然聯(lián)系。可能不同植物組培苗對凝固劑濃度的反應(yīng)有所差異，凝固劑種類和濃度對大花序桉組培苗玻璃化的影響還有待進一步研究。本研究僅針對有可能誘發(fā)大花序桉玻璃化的因子進行常規(guī)探究，關(guān)于植物組織培養(yǎng)玻璃化現(xiàn)象，不同植物起因應(yīng)該不同，但不同起因如何造成相同的結(jié)果即木質(zhì)素合成受阻和細胞分化受抑，則還應(yīng)進行深入研究。

4 結(jié)論

研究不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA和IBA)及不同培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基蔗糖添加濃度、光照時間和溫度)6個因子對大花序桉組織培養(yǎng)過程中玻璃化率的影響結(jié)果表明，6-BA、蔗糖、光照時間和溫度是引起大花序桉試管苗玻璃化現(xiàn)象的4個主要因子。低濃度6-BA(≤0.3 mg/L)時，大花序桉玻璃化率低(≤3.5%)；適當提高蔗糖濃度，能有效控制大花序桉試管苗玻璃化；增加光照時間、降低培養(yǎng)溫度對防治玻璃化有一定作用。大花序桉最佳培養(yǎng)基配方：改良MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.15 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+6 g/L卡拉膠，最佳培養(yǎng)條件：溫度20～25℃，每天10～12 h強度為2 500～4 000 lx全光譜光照。該條件下，能有效控制大花序桉試管苗玻璃率，且有效增殖系數(shù)可維持在較高水平。