土荊芥白粉病菌的分子檢測與鑒定①

范會云 黃 勇 陳衛(wèi)明 黃意成 曾慶錢

（廣東省中藥研究所 廣東廣州 510000）

土荊芥（Chenopodium ambrosioidesL.）為藜科藜屬芳香性草本植物，原產(chǎn)于中美洲、南美和墨西哥南部，全草入藥。2003 年，土荊芥被列為中國首批外來入侵物種之一［1］。目前，僅韓國對土荊芥白粉病有相關(guān)報道，認(rèn)為引起韓國境內(nèi)土荊芥白粉病的病原菌為Erysiphe betae［2］，中國尚未有相關(guān)報道。土荊芥被白粉菌侵染后，初期葉片出現(xiàn)白色粉狀斑點，粉狀斑點不斷擴大或相連成片，后期葉面布滿白色粉層，葉片變黃、變褐。

在傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法中，白粉菌主要以形態(tài)學(xué)為主要鑒定指標(biāo)，但這種分類存在嚴(yán)重不足，如缺少無性世代的特征、許多子實體類型經(jīng)常難以獲得等［3-4］。近年來，植物病原菌在r-DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）被廣泛的應(yīng)用于快速檢測和鑒定植物病原菌［5-6］。目前國內(nèi)尚未見土荊芥白粉病病原菌分子分類系統(tǒng)的相關(guān)研究報道，本文利用分子生物學(xué)技術(shù)對其分類特征及親緣關(guān)系進行研究，以確定土荊芥白粉病菌的種類。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

白粉菌樣本于2020 年5 月20 日采自廣東省博羅縣醪酥村農(nóng)場，寄主植物為土荊芥，樣品編號為MT 799 966。提取白粉菌基因組DNA 所使用的的試劑盒購自O(shè)MEGA bio-tek 公司（貨號：D3390）.

1.2 實驗方法

1.2.1 白粉菌樣本的收集、基因組DNA 的提取和特異序列的擴增

用細(xì)毛刷輕輕地將葉片表面的菌絲與孢子混合物刷到培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)入到2 mL 離心管中，按照試劑盒說明書中的步驟提取土荊芥白粉病菌基因組DNA，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩CR反應(yīng)的引物采用通用引物 ITS1 和 PM6［7-8］，PCR 反應(yīng)所用的試劑是Green Taq Mix （Vazyme：P131-03）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定與分析。

1.2.2 ITS序列分析

將測序所得ITS 序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中Blast 比對分析，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載25 種白粉菌ITS 保守序列（表1），利用軟件MEGA7將測序所得白粉菌序列與數(shù)據(jù)庫中ITS 序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，推演系統(tǒng)進化關(guān)系。

表1 用于同源性比較分析的白粉菌

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與PCR擴增結(jié)果

利用通用引物ITS1 和PM6 進行PCR 擴增獲得的目的片段以及基因組DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送測序，測序獲得長度為535 bp 的堿基序列。

2.2 構(gòu)建土荊芥白粉病菌ITS 序列進化樹的結(jié)果與分析

根據(jù)比對結(jié)果，土荊芥白粉菌MT799966 的ITS 序列與KY399969.1 的ITS 序列最為接近，相似度達到99%以上。說明樣品土荊芥白粉菌與KY399969.1 具有較近的親緣關(guān)系。此外，25 種白粉菌的ITS 序列在265～434 bp 保留著較高遺傳一致性，可能是這個片段起到了保障白粉菌性狀穩(wěn)定遺傳作用。

對25 種不同的白粉菌ITS 序列用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行分析（圖1）。結(jié)果表明，25 種白粉菌的ITS 序列形成2 個比較大的分支，本研究中的樣本MT799966 的ITS 序列與希臘的紅菾菜白粉菌（KY399969.1）和英國的甜菜白粉菌（DQ164440.1）的ITS 序列的距離最近，也就是說本研究中的土荊芥白粉菌與它們的親緣關(guān)系較近，從分子水平上證明，發(fā)生在廣東醪酥村的土荊芥白粉病是由E.betae引起。

圖1 25種白粉菌系統(tǒng)進化樹

3 討論

在傳統(tǒng)的分類方法中，白粉菌的分類主要依據(jù)寄主植物的種類、危害癥狀以及病原菌的顯微特征進行分類，不僅耗時耗力，而且還會受到研究人員的經(jīng)驗和主觀因素的影響，得出錯誤的結(jié)論［7］。

以ITS序列作為一種遺傳分子標(biāo)記的PCR技術(shù)是診斷植物病害的快速、有效的方法。由于真菌ITS 序列具有種內(nèi)保守性強、種間存在變異的特點，使得ITS已經(jīng)成為研究真菌系統(tǒng)發(fā)育和檢測的重要的手段［9］。馬原松等通過對河南省5 種植物（大葉黃楊、鳳仙、豇豆、菊芋和番茄）白粉菌的ITS 序列進行分析，認(rèn)為ITS 序列可用來作為病原菌分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育等研究的依據(jù)。

通過利用特異性引物ITS1/PM6 進行PCR 擴增，獲得本地土荊芥白粉菌的ITS序列，將獲得的序列在NCBI 中進行比對，從中篩選相似度較高的白粉菌種類的ITS序列，建立系統(tǒng)發(fā)育進化樹，發(fā)現(xiàn)引起土荊芥白粉菌的種類屬于Erysiphe屬，本研究結(jié)果將為該病原菌的檢測、分類與鑒定提供理論依據(jù)，同時，也可為防范土荊芥白粉菌的其他寄主植物白粉病的防控提供理論指導(dǎo)。