榆梔止血顆粒對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠PI3K/Akt信號通路及異位內(nèi)膜體積的影響

楊春惠 侯順玉 邱伍英

摘要 目的：探索榆梔止血顆粒對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路及異位內(nèi)膜體積的影響。方法：構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，隨機分為模型組、榆梔止血顆粒低、中、高劑量組、孕三烯酮組，每組12只，另取12只設(shè)為假手術(shù)組，分組處理后處死大鼠，測定大鼠異位子宮內(nèi)膜體積，以免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠異位子宮內(nèi)膜組織中微血管密度（CD31陽性細(xì)胞表達），以免疫酶聯(lián)吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清VEGF、MMP-9、IL-6、TNF-α水平;以蛋白免疫印跡法檢測大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠CD31陽性細(xì)胞比例、血清VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平、異位子宮內(nèi)膜組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均升高（P<0.05）;與模型組比較，榆梔止血顆粒低、中、高劑量組及孕三烯酮大鼠異位子宮內(nèi)膜體積、CD31陽性細(xì)胞比例、血清中VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平、異位子宮內(nèi)膜組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均降低（P<0.05），且榆梔止血顆粒各組之間呈劑量依賴性（P<0.05）;榆梔止血顆粒高劑量組與孕三烯酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：榆梔止血顆粒可抑制子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠內(nèi)膜血管生成，減輕炎性反應(yīng)，進而減小其異位內(nèi)膜體積，可能通過阻滯PI3K/Akt信號傳導(dǎo)實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 榆梔止血顆粒;子宮內(nèi)膜異位癥;異位內(nèi)膜體積;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路

Effects of Yuzhi Zhixue Granules on PI3K/Akt Signal Pathway and Ectopic Endometrial Volume in rats with Endometriosis

YANG Chunhui1，HOU Shunyu2，QIU Wuying2

（1 Gynecology Department，No.1 People′s Hospital of Qujing City of Yunnan Province，Qujing 655001，China; 2 Gynecology Department，Longyan City Second Hospital of Fujian Province，Longyan 364000，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Yuzhi Zhixue Granules on the signal pathway of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） and the volume of ectopic endometrium in rats with endometriosis.Methods：The rat model of endometriosis was established and randomly divided into a model group，a low，middle，high dose Yuzhi Zhixue Granules group and a gestrinone group，with 12 rats in each group.Another 12 were set as sham operation group，the rats were killed after treatment，the volume of ectopic endometrium of rats was measured，the microvessel density （CD31 positive cell expression） was detected by immunohistochemistry，the levels of VEGF，MMP-9，IL-6 and TNF-α in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）; and the expression of PI3K/Akt pathway related proteins was detected by Western blot.Results：Compared with the sham operation group，the proportion of CD31 positive cell，levels of VEGF，MMP-9，IL-6 and TNF-α in serum，the p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in the ectopic endometrium tissues of the model group were all higher （P<0.05）; Compared with the model group，the low，medium and high doses of Yuzhi Zhixue Granules and the ectopic endometrial volume of gestrinone rats，the proportion of CD31 positive cells，serum VEGF，MMP-9，IL-6 and TNF-α level，p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt of ectopic endometrial tissue were all decreased （P<0.05），and there was a dose-dependent relationship between Yuzhi Zhixue Granule groups （P<0.05）; there was no significant difference between high dose Yuzhi Zhixue Granule group and gestrinone group （P>0.05）.Conclusion：Yuzhi Zhixue Granule can inhibit the angiogenesis of endometrium，reduce inflammation and reduce the volume of endometrium，which may be achieved by blocking PI3K/Akt signal transduction.

Keywords Yuzhi Zhixue Granules; Endometriosis; Ectopic endometrial volume; Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signal pathway

中圖分類號：R285.5;R711.71文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.013

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是女性子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)移、侵襲到宮腔以外的部位生長引發(fā)的婦科疾病，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)下腹墜漲疼痛、不孕和痛經(jīng)等臨床癥狀，嚴(yán)重威脅女性的生殖健康，影響其生命質(zhì)量及工作效率[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)及異位內(nèi)膜病灶血管生成在EMs的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，EMs患者血清中炎性細(xì)胞因子及血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）水平均有明顯升高[2-4]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/protein Kinase B，PI3K/Akt）信號可介導(dǎo)炎性反應(yīng)和血管生成過程，抑制該信號激活，可降低炎性反應(yīng)因子表達，減輕神經(jīng)痛大鼠痛覺敏感性[5-6]，并可減弱血管生成，抑制EMs大鼠異位內(nèi)膜生長，提示PI3K/Akt信號可能是EMs的治療靶點之一[7]。榆梔止血顆粒又稱婦科止血顆粒，主要由地榆、墨旱蓮、梔子、牡丹皮、槐花等中草藥組成，具有抗炎作用，其中地榆可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長，減輕炎性反應(yīng)[8-9];牡丹皮配伍生地黃、梔子、當(dāng)歸等可治療子宮內(nèi)膜異位癥、乳腺增生、子宮肌瘤等各種婦科疾病[10]。但榆梔止血顆粒是否可影響EMs大鼠PI3K/Akt信號通路及異位內(nèi)膜生長，目前還不清楚，本文通過構(gòu)建EMs大鼠模型，對此進行探討?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），許可證號為SCXK（湘）2013-0004，雌性，體質(zhì)量200～240 g，所有大鼠均飼養(yǎng)在我院動物房中，溫度25 ℃，相對濕度50%，保持環(huán)境安靜、干凈、透氣，清潔度達到SPF級，12 h/12 h間斷光照，自由飲食、飲水，定期更換墊料，清潔、消毒鼠籠。

1.2.1 藥物 榆梔止血顆粒（山東新時代藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20130019）;孕三烯酮（英國羅素制藥公司，生產(chǎn)批號：A20070002）。

1.2.2 試劑與儀器 大鼠二步法免疫組化試劑盒（北京綠源伯德生物科技有限公司，貨號：E-IR-R212）;DAB試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SNM477-ARB）;大鼠MMP-9 ELISA試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，貨號：XFE1233A）;大鼠IL-6、VEGF及TNF-α ELISA試劑盒、兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、羊抗兔二抗（Abcam公司，美國，貨號：ab100772、ab100786、ab100785、ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab150077）;蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒（上海碧云天公司，貨號：P0027、P0011）等。酶標(biāo)儀（Perkin Elmer公司，美國，型號：XElx800）;病理切片機、包埋機、烤片機（徠卡儀器有限公司，德國，型號：RM2016、EG1160、HI1220）;光學(xué)顯微鏡（尼康公司，日本，型號：SMZ745）;凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司，中國，型號：GIS-500）;蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國，型號：1659001、Trans-Blot Turbo）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用自體移植法建立EMs模型大鼠，具體步驟參考文獻[11]：腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液（劑量為45 mg/kg）麻醉SD大鼠，仰臥固定在操作臺上，備皮、消毒，于下腹部正中開腹、分離子宮，剪取右側(cè)子宮角處的部分組織，剝離子宮內(nèi)膜，使用活檢穿孔器從中取2個片段（直徑為5 mm×5 mm）移植于腸系膜動脈血管豐富處，以抗生素沖洗腹腔、關(guān)腹、縫合。4周后開腹，當(dāng)觀察到移植物清晰可見，呈橢圓形或圓形囊泡，其中充滿透明或含血液體，顏色顯示為淡紅色，高度大于等于2 mm，表面有大量血管，與周圍組織緊密粘連時表示造模成功，共構(gòu)建成功60只，隨機分為模型組、榆梔止血顆粒低、中、高劑量組、孕三烯酮組，每組12只，另取12只僅開腹剪開子宮后縫合，設(shè)為假手術(shù)組。

1.2.2 給藥方法 參照說明書及文獻，進行劑量換算，將榆梔止血顆粒和孕三烯酮[12]分別溶于生理鹽水，配制成濃度為0.1、0.2、0.4 g/mL的榆梔止血溶液及濃度為6 mg/mL的孕三烯酮溶液，藥物處理組均以10 mL/kg的劑量灌胃，模型組和假手術(shù)組以等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)14 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 大鼠異位子宮內(nèi)膜體積測定及標(biāo)本采集末次給藥24 h后，開腹觀察各組大鼠異位子宮內(nèi)膜生長情況，稱量其體積。吸入乙醚麻醉大鼠后處死，經(jīng)腹主動脈取血約5 mL，靜置后離心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，得到血清凍存在-80 ℃冰箱備用，然后解剖取出子宮，剝離假手術(shù)組正常子宮內(nèi)膜組織和其余組異位子宮內(nèi)膜組織，漂洗后各剪取約0.5 g凍存在液氮中備用，剩余子宮組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)低濃度到高濃度梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，采用切片機切片，得到厚度為5 μm的常規(guī)病理切片。

1.2.3.2 大鼠異位子宮內(nèi)膜組織微血管密度檢測CD31是一種血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，廣泛表達于內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處，可介導(dǎo)血管生成，并反映微血管密度，可作為微血管標(biāo)記物[13]。石蠟切片經(jīng)脫蠟、高濃度到低濃度梯度乙醇依次處理后，置于0.3%H2O2溶液中孵育30 min（室溫），以蒸餾水漂洗后分別以5%血清室溫封閉2 h，CD31一抗4 ℃孵育過夜，然后參照說明書的步驟，使用大鼠二步法免疫組化試劑盒、DAB試劑盒進行免疫組化染色，再次以低濃度到高濃度梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片，以光學(xué)顯微鏡觀察著色情況，每個切片任選5個視野拍照，計數(shù)CD31陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，并計算CD31陽性細(xì)胞比例。CD31陽性細(xì)胞比例=CD31陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3.3 大鼠血清中VEGF、MMP-9、IL-6、TNF-α水平檢測 血清置于冰水浴中解凍，采用ELISA試劑盒檢測其中VEGF、MMP-9、IL-6、TNF-α水平，具體操作參照各自說明書的步驟進行。

1.2.3.4 大鼠子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達檢測 采用蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒提取凍存的子宮內(nèi)膜組織中總蛋白并測定其濃度，具體操作參照各自說明書的步驟進行，根據(jù)結(jié)果將各組樣品液蛋白濃度調(diào)整至相同，各組分別取10 μL樣品液上樣，于電泳儀中進行電泳，濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移全部分離蛋白至硝酸纖維膜上，根據(jù)目的蛋白分子量截取條帶放置在小盒中并做好標(biāo)記，以5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后分別以兔源p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次后，以羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶1 000）室溫孵育2 h，TBST漂洗3次后，以化學(xué)發(fā)光法顯色，并使用凝膠成像儀拍攝蛋白條帶，以Quantity One軟件分析圖像，得出各組蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，2組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 榆梔止血顆粒對大鼠異位子宮內(nèi)膜體積生長的影響 假手術(shù)組大鼠未見異位子宮內(nèi)膜組織，模型組大鼠可見明顯異位子宮內(nèi)膜組織。與模型組比較，榆梔止血顆粒低、中、高劑量組及孕三烯酮大鼠異位子宮內(nèi)膜體積均降低，且榆梔止血顆粒各組之間呈劑量依賴性（P<0.05）;榆梔止血顆粒高劑量組和孕三烯酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 榆梔止血顆粒對大鼠異位子宮內(nèi)膜微血管密度（CD31陽性細(xì)胞表達）的影響 與假手術(shù)組正常子宮內(nèi)膜比較，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜CD31陽性細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，榆梔止血顆粒低、中、高劑量組及孕三烯酮大鼠異位子宮內(nèi)膜CD31陽性細(xì)胞比例均降低，且榆梔止血顆粒各組之間呈劑量依賴性（P<0.05）;榆梔止血顆粒高劑量組和孕三烯酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1、表2。

2.3 榆梔止血顆粒對大鼠血清VEGF、MMP-9水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清VEGF、MMP-9水平明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，榆梔止血顆粒低、中、高劑量組及孕三烯酮大鼠血清VEGF、MMP-9水平均降低，且榆梔止血顆粒各組之間呈劑量依賴性（P<0.05）;榆梔止血顆粒高劑量組和孕三烯酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.4 榆梔止血顆粒對大鼠血清IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，榆梔止血顆粒低、中、高劑量組及孕三烯酮大鼠血清IL-6、TNF-α水平均降低，且榆梔止血顆粒各組之間呈劑量依賴性（P<0.05）;榆梔止血顆粒高劑量組和孕三烯酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

2.5 榆梔止血顆粒對大鼠子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達的影響 與假手術(shù)組正常子宮內(nèi)膜組織比較，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，榆梔止血顆粒低、中、高劑量組及孕三烯酮大鼠異位子宮內(nèi)膜組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均降低，且榆梔止血顆粒各組之間呈劑量依賴性（P<0.05）;榆梔止血顆粒高劑量組和孕三烯酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2、表5。

3 討論

EMs傳統(tǒng)上認(rèn)為是由月經(jīng)逆行引起的，作為一種育齡婦女常見的慢性疾病，引起患者痛經(jīng)、性交痛、盆腔疼痛、不孕等并發(fā)癥，威脅女性身心健康，并對國家衛(wèi)生系統(tǒng)及個人家庭造成很大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[14-15]。EMs患者經(jīng)常伴有慢性腹腔炎癥及婦科炎癥，異位內(nèi)膜組織病灶處的血管異常增生及炎性反應(yīng)是EMs的主要致病基礎(chǔ)，抑制炎性反應(yīng)和血管生成對EMs的治療至關(guān)重要[15-16]。榆梔止血顆粒藥方由地榆炭、墨旱蓮、炒梔子、綿馬貫眾、仙鶴草、炒槐花、拳參、大薊、側(cè)柏葉（炒）、棕櫚炭、牡丹皮、茜草、蒲黃炭、生地黃、白芍、黃芩、當(dāng)歸等中藥組成。榆梔止血顆粒主要功效為清熱、涼血、止血，用于排卵性功能失調(diào)性子宮出血所致的月經(jīng)量等癥狀。組方榆梔散中的大部分藥物具有消炎抗菌作用，包括地榆、牡丹皮、梔子、仙鶴草、大薊、黃芩、拳參等，另外這些藥物可改善微循環(huán)，有凝血止血機制作用，藥物包括墨旱蓮、槐花、茜草、當(dāng)歸等改善微循環(huán)和凝血止血作用較強。榆梔止血顆粒的消炎抗菌類中藥可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促使細(xì)菌凋亡，達到抑菌作用，同時這些藥物可降低促炎因子表達，抑制炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[8-10，17]。本文結(jié)果顯示，EMs模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織中CD31陽性細(xì)胞比例、血清VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平升高，IL-6和TNF-α作為促炎因子，可促使炎性反應(yīng)發(fā)生及進展;MMP-9及VEGF可促進子宮內(nèi)膜異位癥的侵襲和血管形成[14-16]，上述結(jié)果表明EMs大鼠異位子宮內(nèi)膜微血管密度明顯增加，出現(xiàn)炎性反應(yīng)。EMs大鼠經(jīng)榆梔止血顆粒處理后，大鼠異位子宮內(nèi)膜體積、CD31陽性細(xì)胞比例、血清中VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平降低，且隨劑量升高而作用增強，表明榆梔止血顆?？赡軠p輕炎性反應(yīng)，抑制異位子宮內(nèi)膜血管生成，進而減小EMs大鼠異位子宮內(nèi)膜體積，對EMs具有治療作用。

PI3K/Akt作為體內(nèi)調(diào)控炎性反應(yīng)及血管生成過程的主要信號，是EMs的一個治療靶點，抑制PI3K及Akt磷酸化，可降低炎性反應(yīng)因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，減輕炎性反應(yīng)并下調(diào)VEGF表達，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，還可抑制EMs大鼠血管生成，減小異位內(nèi)膜體積[7，18-20]。但榆梔止血顆粒是否可調(diào)控EMs大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt通路表達，目前還未見報道。本文研究結(jié)果顯示，EMs模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt升高，提示PI3K/Akt信號參與介導(dǎo)EMs大鼠病理過程。經(jīng)榆梔止血顆粒治療后，大鼠異位子宮內(nèi)膜組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt降低，且呈劑量依賴性，表明榆梔止血顆粒可抑制PI3K/Akt通路激活，改善EMs大鼠癥狀，并隨劑量升高而作用增強。

綜上所述，榆梔止血顆?？山档蚉I3K/Akt通路蛋白的磷酸化水平，減輕炎性反應(yīng)，抑制血管生成，進而減小異位內(nèi)膜體積，為EMs的臨床治療提供了新參考，阻滯PI3K/Akt信號傳導(dǎo)可能是其藥理機制。但本文還未通過上調(diào)和下調(diào)PI3K/Akt信號而做對照驗證，需進行后續(xù)的進一步研究。

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（2020-05-29收稿 責(zé)任編輯：王楊）