不同產(chǎn)地酒女貞子紅景天苷、特女貞苷含量測(cè)定及聚類分析

張柏生 李斌 李茜 于浩楠 李偉

摘要 目的：研究不同產(chǎn)地酒女貞子紅景天苷和特女貞苷含量，為女貞子飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法：采用HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地酒女貞子紅景天苷和特女貞苷含量，運(yùn)用聚類分析法，結(jié)合SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行綜合分析。比較不同產(chǎn)地女貞子炮制前后含量變化。結(jié)果：通過(guò)高效液相色譜測(cè)定得到紅景天苷在0.1～0.5 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，紅景天苷的回歸方程為y=23 961 113.000 0x-219 608.500 0，R2=0.999 2，平均加樣回收率為100.98%，RSD=3.46%（n=6）;通過(guò)高效液相色譜測(cè)定得到特女貞苷在50～250 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，特女貞苷的回歸方程為y=214 086.652 00x-5 991 365.000 0，R2=0.999 7，平均加樣回收率為100.87%，RSD=2.42%（n=6），采用聚類分析可分為三類，其中第三類的成分含量綜合評(píng)分排名較前，說(shuō)明該類地區(qū)酒制女貞子質(zhì)量較好。女貞子炮制后，紅景天苷和特女貞苷均有明顯的提高。結(jié)論：聚類分析具有方法簡(jiǎn)便，精密度高，可預(yù)測(cè)性較好的優(yōu)點(diǎn)，可用于中藥飲片質(zhì)量分析。

關(guān)鍵詞 女貞子;HPLC;聚類分析;含量測(cè)定;紅景天苷;特女貞苷;炮制;質(zhì)量評(píng)價(jià)

Determination of Salidroside and Nuezhenide in Different Producing Areas and Cluster Analysis

ZHANG Bosheng1，LI Bin1，LI Qian1，YU Haonan2，LI Wei1

（1 Affiliated Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China; 2 Xinjiang Medical University College of Traditional Chinese Medicine，Urumqi 830011，China）

Abstract Objective：To study the content of salidroside and nuezhenide in Ligustrum lucidum from different habitats，and to provide evidence for the standard of Ligustrum lucidum.Methods：The contents of salidroside and nuezhenide were determined by HPLC.The results of cluster analysis were combined with SPSS software to analyze the results.The changes of the content of Ligustrum lucidum from different producing areas before and after processing were compared.Results：The linearity of salidroside in the range of 0.1～0.5 mg was determined by high performance liquid chromatography.The regression equation of salidroside was y=23 961 113.000 0x-219 608.500 0，r2=0.999 2，and the average recovery rate was 100.98%，RSD=3.46% （n=6）; the high-performance liquid chromatographic determination of nuezhenide showed a good linear relationship in the range of 50～250 μg.The regression equation of nuezhenide was y=214 086.652 00x-5 991 365.000 0，r2=0.9997，the average recovery rate was 100.87%，RSD=2.42% （n=6），which can be divided into 3 categories by cluster analysis.The third category had higher comprehensive scores，indicating that the quality of the wine cellars in the region was good.After the preparation of Ligustrum lucidum，salidroside and nuezhenide had been significantly improved.Conclusion：Cluster analysis has the advantages of simple method，high precision and good predictability and it can be used for Chinese medicine decoction pieces.

Keywords Ligustrum lucidum; HPLC; Cluster analysis; Content determination; Salidroside; Lutein; Processing; Quality evaluation

中圖分類號(hào)：R284.2;R917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.011

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)。冬季果實(shí)成熟時(shí)采收，除去枝葉，稍蒸或置沸水中略燙后，干燥;或直接干燥。其性味甘、苦，涼。歸肝、腎經(jīng)，功效滋補(bǔ)肝腎，明目烏發(fā)。用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，內(nèi)熱消渴，骨蒸潮熱[1-3]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部收錄其飲片包括女貞子、酒女貞子[4].臨床常用酒女貞子補(bǔ)肝腎作用增強(qiáng)，多用于治療頭暈耳鳴、視物不清、須發(fā)早白。

目前酒女貞子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚存在諸多不足，臨床常用缺少酒女貞子的指標(biāo)成分[5]。本課題運(yùn)用高效液相色譜研究全國(guó)十個(gè)不同地區(qū)所產(chǎn)酒女貞子的紅景天苷和特女貞苷的含量[6-9]，并進(jìn)行聚類分析，旨在為酒女貞子飲片的使用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，型號(hào)：1220）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮機(jī)械有限公司，型號(hào)：RE-52）;電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，型號(hào)：AL204）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DHG-9240A）;超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司，型號(hào)：DL-360A）。

1.2 試劑 紅景天苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111926-201605），特女貞干對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110818-201708），其余試劑均為分析純。

1.3 分析樣品 酒女貞子購(gòu)自全國(guó)十個(gè)地區(qū)，具體見(jiàn)表1，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院田紅林主任藥師鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)的酒制品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 紅景天苷色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-水（20-80）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。理論板數(shù)按紅景天苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，既得[10-12]。

特女貞苷色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-水（38-62）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm。理論板數(shù)按特女貞苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，既得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的紅景天苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得紅景天苷對(duì)照品溶液。

精密稱取干燥至恒重的特女貞苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得特女真苷對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 紅景天苷供試品溶液：取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，既得[13]。

特女真苷供試品溶液：取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，既得。

2.4 線性關(guān)系的考察 精確吸取紅景天苷對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，特女貞苷對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，按“1.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定[14-15]。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的濃度（x）（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到紅景天苷回歸方程為：y=23 961 113.000 0 x-219 608.500 0，R2=0.999 2。特女貞苷回歸方程為：y=214 086.652 00x-5 991 365.000 0，R2=0.999 7。HPLC圖譜見(jiàn)圖1、2。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取紅景天苷對(duì)照品和特女貞苷對(duì)照品溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，共6份，按“1.3.2”項(xiàng)下操作測(cè)定，結(jié)果表明紅景天苷RSD值0.39%，特女貞苷RSD值1.39%，符合精密試驗(yàn)中RSD在3%以內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液，按“1.3.2”項(xiàng)下操作測(cè)定，每隔2 h測(cè)定1次。結(jié)果8 h內(nèi)紅景天苷RSD值1.98%，特女貞苷RSD值0.61%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照樣品溶液制備方法操作，分別制備樣品溶液6份，按“1.3.2”項(xiàng)下操作測(cè)定，結(jié)果表明紅景天苷RSD值1.51%，特女貞苷RSD值1.87%，重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取已知紅景天苷含量的樣品溶液6份，加入紅景天苷對(duì)照品和特女貞苷對(duì)照品溶液1 mL，按“1.3.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明紅景天苷平均回收率為100.98%，RSD值3.46%，結(jié)果見(jiàn)表2。特女貞苷平均回收率為100.87%，RSD值2.42%，結(jié)果見(jiàn)表3。該方法準(zhǔn)確可靠。

2.9 不同產(chǎn)地酒女貞子中紅景天苷和特女貞子的含量測(cè)定 按上述儀器條件對(duì)不同產(chǎn)地女貞子紅景天苷和特女貞子苷樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。從表中可以看出10個(gè)產(chǎn)地酒女貞子中，四川成都產(chǎn)地的紅景天苷和特女貞苷含量最高。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地女貞子紅景天苷和特女貞苷之間也存在著差異。究其原因，可能與氣候、地域、品種等因素有關(guān)?？紤]到上述存在的差異，有必要對(duì)10個(gè)產(chǎn)地女貞子紅景天苷和特女貞苷進(jìn)行聚類分析，找出紅景天苷和特女貞苷的特征值，進(jìn)而為女貞子的合理利用開(kāi)發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

2.10 數(shù)據(jù)分析 聚類分析是將樣品按照品質(zhì)特性相似度逐漸聚合在一起，最終按照類別的綜合性質(zhì)將多個(gè)品種聚合，從而完成聚類分析的過(guò)程。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用組間連接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用平方Eulidean距離，聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖3。將不同產(chǎn)地酒女貞子分為三類，第一類是陜西西安、湖北宜昌、湖南邵陽(yáng)的酒女貞子。第二類為河南開(kāi)封，浙江磐安、江蘇徐州的酒女貞子。第三類為四川成都、安徽亳州、山東曹縣、河北安國(guó)的酒女貞子，該4個(gè)地區(qū)酒女貞子綜合評(píng)分排名較前，說(shuō)明該地區(qū)酒女貞子質(zhì)量較好。在分析過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)各地的特女貞苷的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以作為主要參考指標(biāo)。

2.11 不同產(chǎn)地女貞子炮制前后中紅景天苷和特女貞子的含量變化 按照聚類分析的結(jié)果，測(cè)定四川成都、安徽亳州、山東曹縣、河北安國(guó)相同批次的女貞子生品，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，比較女貞子炮制前后紅景天苷和特女貞苷的含量變化。結(jié)果見(jiàn)下圖4～5。從圖中可見(jiàn)，女貞子炮制后紅景天苷和特女貞苷的含量均有明顯的提高。

3 討論

女貞子主要產(chǎn)于我國(guó)的河南、陜西、江蘇等地，當(dāng)前藥材市場(chǎng)上的女貞子存在以次充好的現(xiàn)象，對(duì)女貞子藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，保障臨床用藥的安全性。紅景天苷是具有苯乙醇結(jié)構(gòu)的苷類成分[16]，研究表明其具有保肝、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等多種藥理作用。特女貞苷為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分[6-7]，作為酒女貞子的特征成分，可以作為衡量酒女貞子的重要指標(biāo)之一。

通過(guò)測(cè)定女貞子炮制前后紅景天苷和特女貞苷的含量，發(fā)現(xiàn)酒制可以提高有效成分含量，增強(qiáng)療效。女貞子臨床上多用于滋補(bǔ)肝腎[17]，用量一般較大。若大劑量長(zhǎng)時(shí)間服用生品，易滑腸致泄。因此，臨床多上多制用[18]。本實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)酒制之后，女貞子的有效成分明顯增加，從而達(dá)到了增效的目的。

聚類分析法[19]作為一種比較客觀合理的統(tǒng)計(jì)方法，可以用于不同產(chǎn)地中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的選擇，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。本研究利用主成分分析法對(duì)不同產(chǎn)地女貞子紅景天苷和特女貞苷的數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的分析，對(duì)不同產(chǎn)地女貞子質(zhì)量狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)和判斷。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果將為女貞子的質(zhì)量評(píng)價(jià)及產(chǎn)地與有效成分含量的關(guān)系提供參考依據(jù)。

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（2019-09-18收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）