健脾益氣攝血方調(diào)控原發(fā)免疫性血小板減少癥腸道免疫機制研究

黃子明 侯麗 李蕊白 王沖 何昊 楊盼 張雅月

摘要 原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）是一種以血小板減少為特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制、發(fā)病原因目前尚未完全明確。ITP的中醫(yī)病名為“紫癜病”。陳信義教授團隊認(rèn)為ITP的病機為“脾氣虧虛、脾不統(tǒng)血”，擬定健脾益氣攝血方，臨床上取得良好療效。并為此開展一系列臨床和基礎(chǔ)研究證實其免疫調(diào)控效果，以期闡明其具體起效機制。文章就陳信義教授在開展國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目臨床試驗過程中對健脾益氣攝血方治療ITP研究所采用的免疫指標(biāo)進行概括和討論。

關(guān)鍵詞 健脾益氣攝血方;原發(fā)免疫性血小板減少癥;免疫

Study on the Intestinal Immune Mechanism of Jianpi Yiqi Shexue Formula in Regulating Primary Immune Thrombocytopenia

HUANG Ziming1，HOU Li1，LI Ruibai1，WANG Chong1，HE Hao2，YANG Pan1，ZHANG Yayue1

（1 Hospital Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Xi′an Medical University，Xi′an 740000，China）

Abstract Immune thrombocytopenia （ITP） is an autoimmune disease characterized by thrombocytopenia，and its pathogenesis and causes have not been completely clarified.ITP′s TCM disease is called “purpura”.Professor CHEN Xinyi′s team thinks that the pathogenesis of ITP is “spleen deficiency and spleen not controlling blood”，so Jianpi Yiqi Shexue Formula has achieved good clinical effect.For this reason，a series of clinical and basic studies have been carried out to confirm its immunomodulatory effect，so as to clarify its specific mechanism.In this paper，Professor CHEN Xinyi summarized and discussed the immune indexes adopted by Jianpi Yiqi Shexue Formula in treating ITP research during the clinical trial of the National Key Basic Research Development Program （“973” Program）.

Keywords Jianpi Yiqi Shexue Formula; Primary immune thrombocytopenia; Immunity

中圖分類號：R242文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.005

原發(fā)免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenia，ITP），原稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，是一種以血小板減少為特征的自身免疫性疾病。多認(rèn)為由于人體內(nèi)細(xì)胞和體液免疫的異常，產(chǎn)生抗血小板自身抗體導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞血小板增多。ITP是臨床上最常見的出血性疾病，其發(fā)病原因目前尚不明確。

1 健脾益氣攝血方的方解及療效

在ITP臨床研究和實踐過程中，中醫(yī)藥的輔助治療或支撐治療顯示出獨特優(yōu)勢。基于ITP在慢性發(fā)病過程證以出血、疲乏等為主要特征，將其歸屬于中醫(yī)學(xué)的“血證”“發(fā)斑”“紫斑”“葡萄疫”“肌衄”“虛勞”等病證范疇。2009年國家中醫(yī)藥管理局組織血液病專家達(dá)成共識，將ITP的中醫(yī)病名統(tǒng)一命名為“紫癜病”[1]。在中醫(yī)辨證施治原則指導(dǎo)下，陳信義教授科研團隊認(rèn)為ITP病機與脾氣虧虛、脾不統(tǒng)血關(guān)系密切，當(dāng)以“健脾益氣攝血”為治療原則，由此擬定出健脾益氣攝血方。該處方由生黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、阿膠、茜草、炙甘草組成。其中黃芪甘溫，歸脾、肺經(jīng)，有補中益氣，升陽固表之效，善治諸氣虛，在方中為君藥。配伍黨參、茯苓、白術(shù)補氣健脾為臣，取四君子湯之意，與黃芪合用，以增強其健脾益氣之效。阿膠補血止血，滋陰潤燥;茜草苦寒，可祛瘀通經(jīng)，涼血止血，二者配伍止血功效更強，亦能防止君臣藥物補益太過，使攝血不留瘀，補血不動血，共為佐藥。炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥，為使藥?？v觀全方，諸藥合用共奏健脾益氣攝血之功。臨床研究表明，健脾益氣攝血方的止血療效要早于糖皮質(zhì)激素，健脾益氣攝血方與激素聯(lián)合使用的療效要優(yōu)于單獨使用激素，證實健脾益氣攝血方在治療有效率、緩解西藥不良反應(yīng)方面具有治療優(yōu)勢，可以快速止血、提升血小板，改善臨床癥狀，且無明顯不良反應(yīng)，治療效果確切[2-4]。

2 健脾益氣攝血方的療效機制研究

在ITP發(fā)病過程中，免疫機制紊亂已被認(rèn)為是其重要發(fā)病機制。陳信義教授在開展國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目臨床試驗過程中，對健脾益氣攝血方開展一系列基礎(chǔ)和臨床研究，證實健脾益氣攝血方具有免疫調(diào)控效果。這些研究主要集中在檢測淋巴細(xì)胞功能指標(biāo)，如淋巴細(xì)胞及其相關(guān)亞群（CD3+CD4+細(xì)胞、CD3+CD8+、CD19+細(xì)胞、CD4+CD25+、CD4+CD25+FoxP3+、CD4+/CD8+）及其分泌的細(xì)胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β1等），免疫球蛋白A（IgA）與血小板相關(guān)抗體（PAIgA、PAIgG、PAIgM），以及腦腸軸的血液神經(jīng)遞質(zhì)上，包括5-羥色胺（5-HT）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）、血管活性腸肽（VIP）、去甲腎上腺素（NE）、縮膽囊素（CCK）等。

ITP的具體發(fā)病機制目前尚未完全明確，近幾年關(guān)于其機制的研究已經(jīng)拓展到眾多領(lǐng)域，其中細(xì)胞免疫和體液免疫異常仍是最經(jīng)典的致病機制。體液免疫紊亂導(dǎo)致ITP發(fā)病這一結(jié)論源于多數(shù)ITP患者血小板表面可以檢測到血小板自身反應(yīng)性抗體的現(xiàn)象，包括血小板相關(guān)抗體（PAIg）和血小板特異性抗體（PSIg），這些抗體主要是IgG型，部分是IgM型和IgA型，這些抗體與血小板膜抗原（如GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅠa/Ⅱa、GPⅥ等）結(jié)合后形成抗原抗體復(fù)合物。血小板表面的自身抗體由B淋巴細(xì)胞分化的漿細(xì)胞產(chǎn)生，直接通過脾臟巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）清除和破壞血小板，或作用于巨核細(xì)胞使血小板的生成減少，從而參與ITP的形成[5]。另一方面，B淋巴細(xì)胞也可以通過分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和維持，降低NK細(xì)胞殺傷功能以及抑制Th1、Th2、Th17細(xì)胞的作用，因此其功能受損與多種自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。

越來越多的研究表明，細(xì)胞免疫機制異常也是ITP發(fā)生發(fā)展的重要使動因素之一[7]。多種T細(xì)胞參與了ITP的發(fā)病，主要包括輔助性T細(xì)胞（Th1、Th2、Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T Cell）等。CD4+T細(xì)胞是T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（Th/Ti）的表面標(biāo)志，具有輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成效應(yīng)細(xì)胞、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞以及活化巨噬細(xì)胞等功能，起輔助、誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫的作用。CD8+T細(xì)胞是T抑制/殺傷細(xì)胞（Ts/Tc）的表面標(biāo)志，CD8+T細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，它能抑制T細(xì)胞活化、抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，起抑制細(xì)胞及體液免疫的作用。CD4+CD25+T細(xì)胞是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種特殊的專職免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可通過抑制T細(xì)胞的活化和增殖來維持自身免疫平衡的作用，還能抑制B細(xì)胞活化和抗體生成，從而減少抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)生[8-9]。

分泌型免疫球蛋白A（SIgA）首先發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，是一種主要存在于乳汁、胃腸液、呼吸道分泌液等外分泌液中的IgA抗體[10]。有研究表明，黏膜系統(tǒng)是免疫防御的第一道防線，而SIgA在黏膜免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮核心作用，對維持機體免疫穩(wěn)定具有重要調(diào)節(jié)效能[11]。NK細(xì)胞是與T、B淋巴細(xì)胞并列的第3類淋巴細(xì)胞，是參與非特異性免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，臨床上常用CD16+CD56+作為NK細(xì)胞的表面標(biāo)志物。研究表明，NK細(xì)胞可以抑制B細(xì)胞的增殖分化，NK細(xì)胞表達(dá)下降或功能異?？稍斐擅庖吖δ苁д{(diào)，增加血小板破壞而介導(dǎo)ITP的發(fā)生[12]。

20世紀(jì)90年代初，隨著神經(jīng)胃腸病學(xué)的建立，腦腸軸、腦腸互動的概念也相繼被提出。腦腸軸是一個雙向調(diào)節(jié)軸，由腦、腸及腸道微生物所構(gòu)成，通過神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)有機的將胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌與中樞神經(jīng)系統(tǒng)連接起來，涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多種調(diào)節(jié)機制。其中發(fā)揮重要作用的物質(zhì)基礎(chǔ)為多種腦腸肽，包括5-羥色胺（5-HT）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）、血管活性腸肽（VIP）、去甲腎上腺素（NE）、縮膽囊素（CCK）等神經(jīng)肽類激素?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，腦腸互動與腦腸肽在維持脾臟生理功能正常運轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用[13-14]。在ITP模型復(fù)制建立過程中，β-EP、VIP、5-HT、NE等神經(jīng)遞質(zhì)或血管活性物質(zhì)也參與了ITP小鼠模型的病理過程。因此，研究給予健脾益氣攝血方治療前后ITP小鼠及ITP患者血清中腦腸肽的變化情況，對于探討健脾益氣攝血方的治療機制有積極作用。

2.1 臨床研究

課題組開展一項中央隨機對照、多中心臨床試驗，觀察健脾益氣射血顆粒對ITP患者免疫功能的影響，共納入272例ITP患者，其中觀察組（健脾益氣攝血組）104例，聯(lián)合組（健脾益氣攝血聯(lián)合潑尼松組）103例，西藥組（潑尼松組）65例;21 d為1個療程;結(jié)果提示，觀察組CD4+CD25+細(xì)胞治療后測定值與治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;第4次訪視點聯(lián)合組檢測的CD3+CD4+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞正常和異常例數(shù)，與觀察組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;各組治療前后血小板抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM測定值組內(nèi)或組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明健脾益氣攝血顆粒可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫發(fā)揮治療ITP的作用[2]。另外，研究結(jié)果也顯示，ITP患者與正常人比較5-HT、VIP、β-EP檢測值均下調(diào)[15];經(jīng)健脾益氣攝血方治療后，健脾益氣攝血方組、健脾益氣攝血方聯(lián)合強的松觀察組β-EP較入組時均升高（P<0.05），VIP均降低（P<0.05），5-HT測定值與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明健脾益氣攝血方對腦腸軸功能具有一定的調(diào)節(jié)效應(yīng)，也參與免疫性血小板減少癥的免疫學(xué)發(fā)病與臨床止血過程[16]。課題組研究研究結(jié)果顯示，經(jīng)健脾益氣攝血方治療前后患者血小板活化功能與NK細(xì)胞分子標(biāo)志物表達(dá)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能證實其起效機制與NK細(xì)胞相關(guān)[16]。

2.2 實驗研究

課題組使用注射APS的免疫造膜法成功建立ITP小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與空白組比較，模型組小鼠血清SIgA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;β-EP水平顯著升高，5-HT、VIP、NE含量則明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），CCK水平則差異無統(tǒng)計學(xué)意義[17-19]。經(jīng)健脾益氣攝血方干預(yù)后，SIgA含量有下調(diào)趨勢，但與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）[17];β-EP、5-HT、VIP、NE水平均向正常值恢復(fù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）[19]，進一步證實了健脾益氣攝血方對腦腸肽的調(diào)控作用。

課題組還觀察健脾益氣攝血方的療效與相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系，研究結(jié)果提示，ITP模型小鼠血清和脾臟中的IFN-γ、IL-17A均高于正常組，TGF-β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-27均低于正常組;經(jīng)過健脾益氣攝血方干預(yù)后，血清中IFN-γ、TGF-β、IL-2、IL-4均向正常值恢復(fù)，脾臟中的TGF-β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A值均向正常值恢復(fù)，提示健脾益氣攝血方對可能通過調(diào)控細(xì)胞因子發(fā)揮治療作用。

3 總結(jié)與討論

陳信義教授將ITP的病機概括為“脾氣虧虛、脾不統(tǒng)血”，在承擔(dān)國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）課題過程中，選擇“脾不統(tǒng)血證”患者或建立脾虛證ITP模型小鼠作為研究對象，以健脾益氣攝血為治療原則，運用健脾益氣攝血方為治療藥物。臨床研究也表明，健脾益氣攝血方在治療ITP上效果顯著。

在研究健脾益氣攝血方效應(yīng)機制時，除了觀察外周血小板計數(shù)、凝血因子等經(jīng)典指標(biāo)外，血小板自身反應(yīng)性抗體、淋巴細(xì)胞及其亞群、血液神經(jīng)遞質(zhì)也可作為藥物干預(yù)機制研究的療效指標(biāo)。綜合“973”計劃所展開的一系列研究發(fā)現(xiàn)，健脾益氣攝血方對血小板相關(guān)抗體無明顯改善效果，淋巴細(xì)胞及其相關(guān)亞群中也僅對CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量有提升作用，因此這二者的觀測結(jié)果尚不能提供健脾益氣攝血方具有明確調(diào)節(jié)免疫功能相關(guān)證據(jù)。血液神經(jīng)遞質(zhì)不僅能調(diào)節(jié)人體免疫，還可參與出血和止血機制。多種神經(jīng)遞質(zhì)中，β-EP、VIP、5-HT、NE可能作為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)在健脾益氣攝血方效應(yīng)機制中發(fā)揮作用。但由于臨床用藥時間設(shè)計僅為21 d，尚不能按照ITP療效評定標(biāo)準(zhǔn)判定療效。因此，需要更進一步的研究去加強這一結(jié)論的科學(xué)性和說服力。

另外，腦腸軸學(xué)說研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)腸道功能有可能在防治多個系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。其中腸道功能與人體免疫功能關(guān)系密切。VIP在ITP發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而腸道免疫系統(tǒng)中的T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等都可分泌VIP。課題組在前期研究基礎(chǔ)上，提出健脾益氣攝血方治療ITP的效應(yīng)機制可能與VIP介導(dǎo)的腸道免疫功能失調(diào)相關(guān)，目前課題組正開展相關(guān)基礎(chǔ)實驗驗證此假說，相信在不久的將來就會得出結(jié)論。

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（2021-01-05收稿 責(zé)任編輯：徐穎）