超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析動物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留

蘇志同 謝金彤 李龍 熊飛 楊健超 彭城

文章選取豬肉、雞肉、魚肉、牛奶、豬肝等基質(zhì)中的四環(huán)素殘留物作為基本檢測樣本，選擇緩沖溶液作為提取液開展超聲提取，經(jīng)過C18固相萃取小柱凈化和脫溶劑的處理之后額外使用甲醇水來對物質(zhì)進行溶解，溶解處理之后將這些物質(zhì)放置在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上完成檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本中四環(huán)素類殘留在10ug/kg-2MRL范圍內(nèi)的回收率為75%左右，RSD<10%，基本上能夠滿足農(nóng)業(yè)部門頒布的公告要求。

四環(huán)素類藥物是一種廣譜抗生素，在畜牧業(yè)、水生生物產(chǎn)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，能夠?qū)游镞M行疾病的診斷、預防和治療，從而更好地促進動物生長，提高飼料的轉(zhuǎn)化率，帶來良好的經(jīng)濟效益。但是從實際應(yīng)用情況來看，四環(huán)素藥物使用存在殘留的現(xiàn)象，人們在長期食用含有四環(huán)素藥物殘留的動物食品會危害到個人健康。為此，需要相關(guān)人員按照規(guī)范的標準仔細檢查動物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留情況。

動物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測實驗

儀器設(shè)備和試劑

動物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測實驗所使用的儀器設(shè)備包含超高效液相色譜-質(zhì)譜儀、R23型離心機、氮吹儀、均質(zhì)器。試劑包含色譜純、實驗用水、緩沖液。另外，還需要按照規(guī)范的比例要求配比儲備液、工作液。即分別稱量各10mg的標準品，使用溶劑分解之后將其轉(zhuǎn)移到100ml 的棕色容量瓶中定容處理，定容處理之后將其放置在零下20攝氏度的環(huán)境下保存。

儀器使用分析條件

超高效液相色譜條件

色譜柱的型號為RP18色譜柱，規(guī)格為100mmx2.1mm，1.7um;色譜柱的溫度為30℃;樣品室內(nèi)溫度為10℃;進樣體積為10ul;流動相A為甲醇;流動相B為0.1%體積比例的甲酸水溶液。

超高效液相質(zhì)譜條件

超高效液相質(zhì)譜電離的方式是大氣壓電噴霧，電離電壓的基本設(shè)定值為3.8KV，錐孔的電壓為30V，離子源的溫度為100℃，維孔反吹氣流量為每小時85L，脫溶劑氣的溫度為300℃，脫溶劑的氣流量為每小時400L，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式。超高效液相質(zhì)譜條件基本情況如表一所示。

試驗方法

提取

提取動物組織試樣10g放置在100ml 的離心管中，在其中加入20ml 的溶劑均勻的提取3分鐘，之后按照每分鐘4000轉(zhuǎn)的速度使用離心機轉(zhuǎn)動5分鐘，將上面的清液放置在不具備水硫酸鈉的漏斗中，而后轉(zhuǎn)移到雞心瓶中，殘渣使用溶劑反復提取，在一定時間之后進行最終的兩次提取，合并形成提取液，而后將提取液放置在40℃的環(huán)境下減壓快速濃縮到干燥的狀態(tài)，準備凈化。

凈化和測定

在上文等待凈化的提取液中加入比例在99.8%左右的甲酸水溶液0.8ml，按照渦旋的狀態(tài)緩和攪拌處理，將溶解液轉(zhuǎn)移到10ml的離心管中，按照每分鐘4000轉(zhuǎn)的離心機轉(zhuǎn)動速度轉(zhuǎn)動兩分鐘，對下層清液體過濾，過濾后的樣品放置到樣品瓶中，按照規(guī)范的標準來完成測試。

實驗結(jié)果和討論

優(yōu)化前期處理條件

在對比乙腈和丙酮作為提取液后的提取率之后發(fā)現(xiàn)乙腈的提取效果良好，而出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是乙腈的極性比丙酮大，對被檢測物體的溶解性也比較強，因而在實驗操作的時候會選擇乙腈來作為基本提取溶液。

在凈化優(yōu)化的過程中考慮到動物組織中的油脂比較多，因而會使得儀器設(shè)備在開展污染檢測的時候被背景干擾。為了達到理想的凈化效果，需要對設(shè)備開展去油處理。同時，考慮到被檢測物的極性比較大，和乙烷不會融合，因此使用正乙烷來去除油脂，減少基質(zhì)對儀器設(shè)備測量的干擾。

色譜條件的優(yōu)化

磺胺和喹諾酮藥物和乙腈適合融合在一起，因此會選擇乙腈和水的混合體來作為基本流動相。考慮到磺胺藥物分子結(jié)構(gòu)和喹諾酮藥物的介質(zhì)含量，因此，在檢測的時候需要在流動相中加入甲酸這種物質(zhì)，通過甲酸的增加來提升離子化效率。

一系列的試驗結(jié)果證明，在甲酸和水溶液處于水相狀態(tài)的時候，被檢測物質(zhì)的離子效率比較高，檢測靈敏度也比較精準。因此，在試驗操作的時候選擇流動相體系來組成乙腈和甲酸水溶液。

色譜行為

在儀器工作條件下對每升1mg的混合標準溶液開展檢測，各個獸藥總離子流色譜圖如圖一所示。

圖一：各個獸藥總離子流色譜圖

（1-10分別代表磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉。）

標準曲線和檢出限

為了能夠消除基質(zhì)效應(yīng)對定量測定的影響，要重新配置包含磺胺、喹諾酮的混合溶液。在儀器工作環(huán)境中對一系列的試驗進行分析，并繪制出標準的曲線，根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一升范圍內(nèi)的各個標準物質(zhì)在0.01mg到0.2mg的范圍內(nèi)會呈現(xiàn)出一種線性的關(guān)系，相關(guān)系數(shù)超過了0.996的比例，總體上會以三倍信噪比來作為基本檢測方式。

方式回收率和精密度

在10m空白動物組織試樣中分別加入0.01mg、0.05mg和0.2mg三個濃度的19種混合標準溶液作為基本回收檢驗的樣本溶液， 平行測定五次，回收率和相對標準偏差如表二所示。

樣品分析

規(guī)范的試樣方式對市場上的肉類進行分析，最終發(fā)現(xiàn)磺胺喹惡啉、恩諾沙星、諾氟沙星在雞肉中都有檢出，其質(zhì)量分數(shù)分別為0.1/0.01/0.01mg，魚和熟肉串中檢定出了恩諾沙星，質(zhì)量分數(shù)均為0.01mg，牛肉和豬肉的試羊檢測沒有出現(xiàn)任何獸藥。

綜上所述，文章實驗打造出了三種四環(huán)素類藥物的LC-MS/MS檢測方式，在實驗操作的過程中對加標量的樣品開展了檢測，檢測結(jié)果證明前處理方式回收率在95%到105%之間，回收率在標定的范圍內(nèi)。固相萃取方式穩(wěn)定，且色譜柱的重現(xiàn)性比較高，由此證明這種方法適合應(yīng)用在動物源性食品中四環(huán)素殘留藥物的檢測工作中。

蘇志同1? ?謝金彤1? ?李? 龍2? ?熊? 飛1? ?楊健超1? ?彭? 城1

1.南京海關(guān)動植物與食品檢測中心

2.白銀市食品檢驗檢測中心