銀花青蒿梔子方灌腸劑體內(nèi)抗A6型柯薩奇病毒的作用及機(jī)制研究

李 菲，李 娟，張振杰，侯 林，崔清華，田景振*

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院，新發(fā)傳染病病因流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271016

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

A6 型柯薩奇病毒（coxsackievirus A6，CV-A6）屬于小核糖核酸病毒科的腸道病毒A 組，自2013年逐漸成為手足口病暴發(fā)流行的主要病原體之一[1-3]。CV-A6 不同于CV-A16 和71 型腸道病毒（enterovirus 71，EV71），后兩者P1 區(qū)序列相似度極高，靶受體、致病機(jī)制和抗病毒藥物等方面存在相同或相似之處[4]，EV-71 的相關(guān)研究為CV-A16 的研究和應(yīng)對(duì)奠定了良好基礎(chǔ)，目前CV-A6 的相關(guān)研究較少[5]。

清熱解毒類中藥不僅能夠抗病毒、消炎、退熱，還能提高人體免疫力，治療病毒性感染疾病具有多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)[6-7]。灌腸給藥具有良好的安全性和順應(yīng)性，適合中藥發(fā)揮復(fù)方優(yōu)勢(shì)[8]。銀花青蒿梔子方源于名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，組方為金銀花3～15 g、青蒿6～25 g 和梔子3～12 g，具有清熱解毒、疏風(fēng)解表的功效[9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)該方開發(fā)的中藥制劑對(duì)甲型H1N1 流感病毒、單純皰疹病毒、腺病毒及腸道病毒EV71 和CV-A16 等均有抑制作用[10-11]?；谡n題組前期研究發(fā)現(xiàn)銀花青蒿梔子方具有抗CV-A6 作用，制備了銀花青蒿梔子方灌腸劑，本研究考察銀花青蒿梔子方灌腸劑體內(nèi)抗CV-A6 的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

ICR 孕鼠16 只，8 周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001）。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（22±1）℃、濕度（55±5）%的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)規(guī)定（批準(zhǔn)號(hào)2018049）。

1.2 病毒和細(xì)胞

CV-A6引自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所毒種室；人橫紋肌瘤細(xì)胞RD 引自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所病毒研究室。

1.3 藥材

金銀花（批號(hào) 20170306）、青蒿（批號(hào)20170306）、梔子（批號(hào)20170306）均購(gòu)自泰安市金泰聯(lián)藥店，經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)高洪莉教授鑒定分別為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾、菊科蒿屬植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分、茜草科梔子屬植物梔子Gardenia jasminoidesElis 的干燥果實(shí)。

1.4 藥品與試劑

銀花青蒿梔子方灌腸劑（批號(hào)20170923）、多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；qPCR 試劑盒（批號(hào)03907）購(gòu)自天根生化科技有限公司；Trizol（批號(hào)1705263）購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA 試劑盒（批號(hào)128170744）購(gòu)自聯(lián)科生物；Procarta Plex多因子檢測(cè)試劑盒（批號(hào)148087012）購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體（批號(hào)G1211）購(gòu)自Servicebio 公司；Tunnel 試劑盒（批號(hào)11684817910）、DAPI（批號(hào)216276）購(gòu)自瑞士Roche 公司；山羊血清（批號(hào)AR1009）購(gòu)自博士德生物工程有限公司。

1.5 儀器

1300 A2 生物安全柜、371 型CO2恒溫培養(yǎng)箱、7500 Fast 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；倒置顯微鏡（日本尼康株式會(huì)社）；Infinite M 200 Pro 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；MAGPIX 液相芯片分析系統(tǒng)（美國(guó)Luminex 公司）；石蠟切片機(jī)、EMUC7 型超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；JEM-1200EX Ⅱ型透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會(huì)社）。

2 方法

2.1 銀花青蒿梔子方灌腸劑的制備

將金銀花、青蒿、梔子粉碎為粗粉，分別稱取上述藥材粗粉120、600、80 g，加入8 倍量55%乙醇浸泡2 h，超聲提取30 min，提取2 次，抽濾，合并濾液，40 ℃減壓回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.10；加入3%聚山梨酯-80 超聲分散均勻，加入3%水溶性氮酮和0.2%山梨酸鉀，以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8，加入純化水至1 L，得到0.8 g/mL（以生藥量計(jì)）的褐色澄清灌腸劑。

2.2 造模、分組與給藥

10日齡ICR 乳鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、銀花青蒿梔子方灌腸劑（2.6 g/kg）[11]組和利巴韋林（10 mg/kg）組，每組14 只。除對(duì)照組外，其余各組ip 0.1 mL CV-A6（滴度為107.4TCID50/mL）。銀花青蒿梔子方灌腸劑組感染后1 h 內(nèi)灌腸25 μL 藥物，利巴韋林組im 藥物，模型組和對(duì)照組灌腸等體積純化水，2 次/d，連續(xù)14 d。第4 天各組隨機(jī)取4 只乳鼠，乙醚吸入麻醉后內(nèi)眥取血，分離血清，-80 ℃保存，用于細(xì)胞因子測(cè)定；取心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，-80 ℃保存，用于病毒載量測(cè)定。

2.3 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠血清中細(xì)胞因子水平的影響

按ELISA 試劑盒說明書測(cè)定血清中TGF-β 水平；按Procarta Plex 多因子檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定血清中白細(xì)胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、IL-5、IL-6、IL-12 p70、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）水平。

2.4 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒載量的影響

取凍存的心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，加入液氮研磨，按照試劑盒說明書提取各組織總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物及探針序列：上游引物5’-CCTGAATGCGGCTAATCC-3’，下游引物5’-TTGTCACCATWAGCAGYCA-3’，探針5’-FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-BHQ1-3’。

2.5 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率和臨床評(píng)分的影響

每天觀察、記錄乳鼠的癥狀變化，統(tǒng)計(jì)生存率，按照文獻(xiàn)方法[12]對(duì)臨床癥狀進(jìn)行評(píng)分。

2.6 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病理變化的影響

末次給藥3 h 后，各組其余動(dòng)物脫頸椎處死，取心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，于10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制備厚度為5 μm 的切片，進(jìn)行HE 染色，于顯微鏡下觀察。

2.7 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠脊髓頸膨大段超微結(jié)構(gòu)的影響

取脊髓頸膨大段，于2.5%戊二醛、1%四氧化鋨中固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制備厚度為50～60 nm 超薄切片，進(jìn)行醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，于TEM 下觀察。

2.8 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達(dá)的影響

取心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，以自制多克隆抗體[13]為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體為二抗，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，于顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件分析陽性區(qū)域的吸光度（A）值。

2.9 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠骨骼肌組織細(xì)胞凋亡的影響

取“2.6”項(xiàng)下骨骼肌石蠟切片，脫水后用組化筆畫圈，加入10%山羊血清，室溫封閉30 min；吸除血清，加入Tunnel 反應(yīng)混合液，37 ℃孵育1 h；TBS 洗滌3 次，5 min/次；滴加DAPI 染色，避光室溫孵育10 min；TBS 洗滌，以抗熒光衰減封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠血清中細(xì)胞因子水平的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，銀花青蒿梔子方灌腸劑組乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β 水平均顯著降低（P＜0.01、0.001）。

圖1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β 水平的影響Fig.1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on levels of IL-5,IL-6,IL-12 p70,TNF-α,IFN-γand TGF-β in serum of CV-A6 infected ICR mice

3.2 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒載量的影響

如圖2所示，模型組乳鼠骨骼肌、延髓、脊髓、心臟和肺組織中的病毒載量均較高，其中骨骼肌組織的病毒載量最高；與模型組比較，銀花青蒿梔子方灌腸劑顯著降低了后肢肌、脊髓、延髓、心臟和肺組織的病毒載量（P＜0.05、0.01）。

圖2 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒載量的影響Fig.2 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral load in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

3.3 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率和臨床評(píng)分的影響

如圖3所示，10日齡ICR 乳鼠ip 感染CV-A6，5 d 后開始出現(xiàn)急性弛緩性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）的典型癥狀，14 d 后生存率為10%。銀花青蒿梔子方灌腸劑組較少出現(xiàn)AFP 癥狀，運(yùn)動(dòng)能力較正常，臨床評(píng)分低，給藥14 d 后生存率為70%，藥效優(yōu)于利巴韋林。

圖3 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠生存率和臨床評(píng)分的影響Fig.3 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on survival rate and clinical score of CV-A6 infected ICR mice

3.4 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病理變化的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組乳鼠骨骼肌出現(xiàn)嚴(yán)重的肌纖維溶解、斷裂，肌束稀疏；脊髓前角和延髓中的神經(jīng)元出現(xiàn)變性、壞死；心肌泡沫化，心肌纖維有輕度的溶解、斷裂；肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維化。銀花青蒿梔子方灌腸劑組骨骼肌基本無肌束斷裂，肌纖維排列較為整齊；脊髓前角和延髓中的神經(jīng)元壞死程度有一定改善；心肌無出血現(xiàn)象，心肌纖維排列較為整齊；肺纖維化程度明顯減輕，肺泡形態(tài)接近正常。

圖4 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病理變化的影響(HE,×200)Fig.4 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on pathological changes in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice(HE,× 200)

3.5 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠脊髓頸膨大段超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，對(duì)照組脊髓前角神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，在核周分布均勻，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平行排列，核糖體顆粒豐富，形成發(fā)育良好的尼氏體區(qū)域（圖5-A），髓鞘板層結(jié)構(gòu)排列整齊（圖5-B），核內(nèi)染色質(zhì)均勻，核仁大而圓，線粒體呈橢圓形，嵴清晰（圖5-C）。模型組脊髓前角神經(jīng)元細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并有脫顆粒，核糖體顆粒分散，未形成尼氏體；核膜凹凸不平，核仁變小，異染色質(zhì)在核邊緣聚集；胞質(zhì)廣泛水腫，線粒體腫脹變形，基質(zhì)稀疏，大部分嵴膜不清甚至消失，外膜膨脹隆起，形成空泡（圖5-D）；髓鞘板層結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)囊性間隙，中間有纖維填充（圖5-E）；呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象（圖5-F）。銀花青蒿梔子方灌腸劑組脊髓前角神經(jīng)元細(xì)胞接近正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本為平行狀排列，水腫減輕，游離核糖體減少，表明細(xì)胞合成功能旺盛，有利于神經(jīng)軸突的修復(fù)（圖5-I）；線粒體形態(tài)較改善，數(shù)量增加（圖5-G）；髓鞘板層結(jié)構(gòu)散亂和分離程度減輕（圖5-H）。利巴韋林組脊髓前角神經(jīng)元細(xì)胞器粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸恢復(fù)正常的平行狀排列，游離核糖體減少（圖5-J），線粒體形態(tài)較改善，異染色質(zhì)在核邊緣聚集（圖5-L）；髓鞘板層結(jié)構(gòu)散亂，中間有纖維填充（圖5-K）。

圖5 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠脊髓頸膨大段超微結(jié)構(gòu)的影響(×10 000)Fig.5 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on ultrastructure of spinal cord slices in CV-A6 infected ICR mice(× 10 000)

3.6 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達(dá)的影響

如圖6所示，病毒抗原在模型組乳鼠后肢骨骼肌中病毒表達(dá)最為嚴(yán)重，脊髓和延髓的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞有病毒抗原分布，病毒抗原在心臟中的分布相對(duì)較少，在肺組織中分布廣泛。與模型組相比，銀花青蒿梔子方灌腸劑組后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心臟和肺組織的陽性表達(dá)均減少。如表1所示，銀花青蒿梔子方灌腸劑組骨骼肌和肺組織病毒抗原表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。

圖6 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達(dá)的影響(×200)Fig.6 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice(× 200)

表1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達(dá)的影響Table 1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata,and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

表1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達(dá)的影響Table 1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata,and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05#P <0.05 ##P <0.01 vs control group;*P <0.05 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1)A 值骨骼肌 脊髓 延髓 心臟 肺對(duì)照 — 0.09±0.02 0.09±0.01 0.09±0.00 0.09±0.01 0.09±0.01模型 — 0.21±0.04## 0.18±0.03## 0.16±0.03# 0.15±0.02# 0.19±0.04##利巴韋林 0.01 0.16±0.02 0.12±0.02 0.13±0.01 0.13±0.02 0.15±0.02銀花青蒿梔子方灌腸劑 2.60 0.15±0.01* 0.14±0.03 0.12±0.01 0.12±0.01 0.13±0.02*

3.7 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR乳鼠骨骼肌組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖7所示，與對(duì)照組相比，模型組乳鼠骨骼肌凋亡細(xì)胞增多；與模型組相比，各給藥組乳鼠骨骼肌凋亡細(xì)胞減少，表明銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)病毒導(dǎo)致的肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

圖7 銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 感染的ICR 乳鼠骨骼肌組織細(xì)胞凋亡的影響(×200)Fig.7 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on muscle cell apoptosis of CV-A6 infected ICR mice(× 200)

4 討論

手足口病典型臨床癥狀為發(fā)熱，手、口、足、臀等部位出疹，部分患兒出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、AFP 等重癥表現(xiàn)[14]。ICR 乳鼠感染CV-A6 后出現(xiàn)的主要癥狀為AFP，銀花青蒿梔子方灌腸劑能夠提高病毒感染得乳鼠生存率，改善其臨床癥狀。ICR 乳鼠感染CV-A6 后多個(gè)組織臟器發(fā)生病理損傷，其中骨骼肌病理嚴(yán)重?fù)p傷、脊髓前角神經(jīng)元壞死、延髓的錐體束受損與其癥狀表現(xiàn)主要為AFP 有一定的關(guān)聯(lián)性。銀花青蒿梔子方灌腸劑能夠減輕骨骼肌、脊髓、肺臟等組織的病理損傷，降低病毒抗原表達(dá)。ICR 乳鼠感染CV-A6 后骨骼肌、脊髓、延髓和肺組織中病毒載量高，與骨骼肌和脊髓是EV71 復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位相似[15]；銀花青蒿梔子方灌腸劑顯著降低上述組織中的病毒載量，體現(xiàn)出良好的抗CV-A6 活性。

病毒侵犯脊髓前角灰白質(zhì)區(qū)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，導(dǎo)致肌肉特別是肢體肌肉發(fā)生不對(duì)稱弛緩性麻痹。EV71感染的乳鼠骨骼肌細(xì)胞和Vero 細(xì)胞中線粒體空泡化，表明線粒體可能是其直接損傷靶點(diǎn)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CV-A6 感染導(dǎo)致脊髓組織的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，如前角神經(jīng)元線粒體發(fā)生腫脹變形、形成空泡等；銀花青蒿梔子方灌腸劑組脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常，表明銀花青蒿梔子方灌腸劑對(duì)CV-A6 致神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷有改善作用。

病毒感染可以通過多個(gè)信號(hào)通路觸發(fā)宿主細(xì)胞凋亡，凋亡的發(fā)生可以促進(jìn)病毒和炎性細(xì)胞因子的釋放，是病毒感染導(dǎo)致臨床病癥和病理改變的原因之一[4,17]。EV71 和CV-A16 均通過半胱氨酸蛋白酶（Caspase）途徑誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡[18-19]。本研究結(jié)果顯示，銀花青蒿梔子方灌腸劑能夠抑制CV-A6 致骨骼肌細(xì)胞凋亡，從而抑制病毒和炎性細(xì)胞因子的釋放，減輕病毒感染導(dǎo)致的癥狀和病理損傷，發(fā)揮抗病毒作用。

病毒感染可以過度激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴[20-21]，細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致局部與全身的炎性反應(yīng)，造成組織損傷、器官功能的喪失甚至死亡[22]。人感染登革病毒后，血清中IL-8、IFN-γ、TGF-β 和IL-10 水平升高[23]；Balb/c 小鼠感染CV-B3 后，血清中IL-6、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-17α、IFN-γ、TNF-α 水平均顯著升高[24]。本研究結(jié)果顯示，CV-A6 感染導(dǎo)致ICR 乳鼠血清中多種細(xì)胞因子水平顯著升高，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[25]；與模型組比較，銀花青蒿梔子方灌腸劑顯著降低血清中TGF-β、IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α 和IFN-γ 水平，從而減輕細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致的炎性損傷，發(fā)揮抗病毒作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)銀花青蒿梔子方灌腸劑具有良好的抗CV-A6 作用，能夠提高CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率并改善臨床癥狀，可能與其減少脊髓前角神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡、干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴、保護(hù)臟器功能等有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突