豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、支原體混合感染病例的實驗室診斷

成虹松，李 梅，方 天，宋 春，陳 靜，楊 鵬，尹德晶，張雙翔，程振濤*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008)

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的高度接觸傳染性疾病，世界各地均有發(fā)生，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物傳染病；被感染的野豬種群可作為病毒的儲藏庫，對家豬構(gòu)成潛在威脅，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)[1]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的急性、高度傳染性疾病，能導(dǎo)致懷孕母豬在妊娠后期出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)或產(chǎn)死胎等繁殖障礙，并可引起新生仔豬呼吸系統(tǒng)癥狀[2]。豬支原體肺炎(MPS)是由豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)引起的以氣喘為主要癥狀及肺部對稱性“肉樣變”為主要病理變化的慢性接觸性呼吸道傳染病，在世界各地普遍存在[3]。2020年9月初貴定縣某豬場2頭豬發(fā)病，主要表現(xiàn)腹瀉、呼吸困難、皮膚紫斑、厭食、弓背、精神沉郁等癥狀。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查及臨床癥狀懷疑為多病原混合感染，特采集病料進行實驗室檢測診斷，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測病料無菌采集該養(yǎng)殖場2頭發(fā)病豬的肺臟、肝臟、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟組織樣品作為檢測病料。

1.2 主要試劑DNA/RNA提取試劑盒、豬瘟病毒RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒、支原體PCR檢測試劑盒(購自北京世紀元亨公司)；2 000 bp DNA Marker(購自大連寶生物工程有限公司)；鮮血瓊脂培養(yǎng)基(由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室提供)。

1.3 主要儀器SYGENE 電泳凝膠成像儀(GENE公司)、臺式高速冷凍離心機(ScanSpeed 1730R，丹麥LABOGENE公司)、迷你離心機(MINI，丹麥ScanSpeed公司)、-20 ℃冰箱(BCD-215KCF)、可調(diào)節(jié)微量移液器(0～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL，德國Eppendorf公司)。

1.4 細菌分離培養(yǎng)在無菌條件下將肝臟樣品分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。

1.5 相關(guān)病原核酸提取分別取2頭病豬肺臟、肝臟、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟組織，每份組織分別從3個不同位置稱取樣品約1 g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5 g于研磨器中，加入生理鹽水1.5 mL研磨，勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取上清，用DNA/RNA試劑盒按說明書方法提取總DNA和RNA。

1.6 病原核酸檢測

1.6.1 豬瘟病毒核酸檢測以提取的總RNA為模板，構(gòu)建RT-PCR反應(yīng)體系20 μL：RT-PCR反應(yīng)液16.8 μL，酶混合液1.2 μL，模板RNA 2 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR產(chǎn)物10 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴增片段235 bp)。

1.6.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸檢測以提取的總RNA為模板，構(gòu)建RT-PCR反應(yīng)體系20 μL：RT-PCR反應(yīng)液16.8 μL，酶混合液1.2 μL，模板RNA 2 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min。取RT-PCR產(chǎn)物10 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴增片段436 bp)。

1.6.3 支原體核酸檢測以提取的總DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系20 μL：PCR反應(yīng)液16 μL，TaqDNA聚合酶2 μL，DNA模板2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL混合上樣緩沖液2 μL，點樣于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴增片段602 bp)。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)培養(yǎng)基上未見菌落生長，說明無細菌感染。

2.2 豬瘟病毒核酸檢測由圖1可見：2份樣品經(jīng)過RT-PCR擴增，均出現(xiàn)235 bp的豬瘟病毒特異性條帶，提示2頭病豬均存在豬瘟病毒感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標準； +：陽性對照； -：陰性對照； 1～2：檢測樣品圖1 豬瘟病毒RT-PCR擴增結(jié)果

2.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸檢測由圖2可見：經(jīng)過RT-PCR擴增，1號樣品未出現(xiàn)特異性條帶，2號樣品出現(xiàn)436 bp的豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性條帶，提示2號病豬存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標準； +：陽性對照； -：陰性對照； 1～2：檢測樣品圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR擴增結(jié)果

2.4 支原體核酸檢測由圖3可見：經(jīng)過PCR擴增，2份樣品均出現(xiàn)602 bp的支原體特異性條帶，提示2頭病豬均存在支原體感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標準； +：陽性對照； -：陰性對照； 1～2：檢測樣品圖3 支原體PCR擴增結(jié)果

3 結(jié)論

通過相關(guān)病原核酸檢測，確診病豬存在豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、支原體混合感染。

4 討論

4.1近年來隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，豬感染的病原越來越復(fù)雜，多種病原混合感染的情況也越來越嚴重，病豬的治療變得愈發(fā)困難。豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染，豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒混合感染，甚至多種病毒混合感染的病例常有報道[4～6]。除了病毒引起的混合感染外，也有細菌或其他病原的混合感染，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、鏈球菌、沙門氏菌混合感染[7，8]。本次檢測結(jié)果顯示該豬場存在豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、支原體混合感染。

4.2為預(yù)防豬病的發(fā)生，豬場要做好防控措施，采取“預(yù)防為主，養(yǎng)防結(jié)合”的方針，做好豬場的免疫及防疫工作，根據(jù)豬場的流行病學(xué)調(diào)查和實際情況制定合理的疫苗免疫程序。引入仔豬和種豬時需要嚴格按照引種程序進行檢疫和隔離觀察，避免引入病豬或攜帶病原的豬，給豬場帶來生物安全隱患。其次要加強豬場的管理，加強對飼料營養(yǎng)及安全性的重視，避免由于病原污染飼料而導(dǎo)致豬群感染。豬群管理進行細化分類，定期檢疫監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)疫情及時處理和凈化，保障豬群的衛(wèi)生安全。