啟動急性痛風(fēng)發(fā)作炎性細(xì)胞因子的研究*

陸群群 張 永 李 琳 李曉玲 方 旋 張 敏 項 楠 朱子文 陶金輝,

1 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,安徽省合肥市 230000; 2 安徽省宿州市立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科;3 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科; 4 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

痛風(fēng)是一種與嘌呤代謝障礙相關(guān)、以關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的炎癥性疾病。長期嘌呤代謝活躍、嘌呤攝入過多或尿酸排泄障礙，均可導(dǎo)致高尿酸血癥，而長期高尿酸血癥會引起關(guān)節(jié)及周圍軟組織尿酸鹽(MSU)晶體的沉積，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的急性關(guān)節(jié)和軟組織炎癥、痛風(fēng)石沉積、慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損壞等。

目前普遍認(rèn)為有多種炎性細(xì)胞因子參與了痛風(fēng)的發(fā)病，但尚不明確是否都參與了該病炎癥反應(yīng)的啟動。細(xì)胞因子的產(chǎn)生與 NALP3炎癥小體的激活有關(guān)[1]，沉積在關(guān)節(jié)部位的MSU通過MSU-NALP3-IL-1β信號通路激活炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)痛風(fēng)的發(fā)作，IL-1β是導(dǎo)致痛風(fēng)急性發(fā)作的主要炎癥性細(xì)胞因子[2]。痛風(fēng)的病因和發(fā)病機制尚未明確，盡管MSU被公認(rèn)是痛風(fēng)發(fā)病的主要致病信號，但不能解釋臨床上存在的一些現(xiàn)象，比如：為什么某些患者關(guān)節(jié)內(nèi)存在大量尿酸鈉晶體沉積抑或是痛風(fēng)石形成，但卻沒有急性關(guān)節(jié)炎發(fā)作？我們課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)ATP是除MSU外導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)作的第二致病信號，ATP受體P2X7R的功能決定了高尿酸血癥患者是否會出現(xiàn)痛風(fēng)發(fā)作[3]，臨床上5%～15%的高尿酸血癥患者會發(fā)展為痛風(fēng)，而高尿酸血癥患者是否出現(xiàn)痛風(fēng)發(fā)作，考慮到主要因機體對痛風(fēng)致病信號協(xié)同刺激的反應(yīng)不同，鑒于MSU和ATP均為痛風(fēng)的致病信號，本研究主要通過MSU+ATP二者共同刺激痛風(fēng)患者和從未有痛風(fēng)發(fā)作的高尿酸血癥患者的外周血白細(xì)胞，通過分析培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子濃度差異，探討不同細(xì)胞因子在痛風(fēng)發(fā)作啟動中的作用，從而力求找到啟動痛風(fēng)炎癥的細(xì)胞因子。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 課題組于2013年1月—2014年5月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)共納入了80例男性患者，分為痛風(fēng)組、高尿酸血癥組，每組40例，實驗中所納入患者采血前均知情同意。痛風(fēng)組年齡15～74歲，平均年齡為(53.4±15.6)歲；高尿酸血癥組年齡24～77歲，平均年齡為(50.9±14.1)歲；兩組年齡構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組間具有可比性。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)痛風(fēng)組均來自本院風(fēng)濕科門診部和住院部，均符合2015年美國風(fēng)濕病協(xié)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)提出的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，為排除痛風(fēng)急性發(fā)作等干擾因素影響，鑒于痛風(fēng)患者多以男性為主，本研究納入者均為穩(wěn)定期男性痛風(fēng)患者；(2)高尿酸血癥組作為對照組，均來自本院健康體檢中心及內(nèi)分泌科等相關(guān)科室，鑒于痛風(fēng)的發(fā)病主要在高尿酸血癥5年內(nèi)發(fā)病，故納入者均為非同日兩次空腹血尿酸>420μmol/L(7mg/dl)的男性，病程均>10年且從未痛風(fēng)發(fā)作，以確保入選的高尿酸血癥患者不會出現(xiàn)痛風(fēng)急性發(fā)作。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有感染、其他自身免疫性疾病及慢性消耗性疾病者等。

1.3 細(xì)胞刺激培養(yǎng) 本研究使用的白細(xì)胞均來源于痛風(fēng)和高尿酸血癥患者的外周血：上午7:00采集痛風(fēng)或高尿酸血癥患者外周靜脈血10ml，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后于2h內(nèi)進(jìn)行處理。用沉淀法提取出白細(xì)胞，然后利用顯微鏡計數(shù)法，將之均分為2份后加入培養(yǎng)板中，并分別加入溶于培養(yǎng)基的尿酸鹽(MSU)和MSU+苯甲酰苯甲酸三磷酸腺苷(BZ-ATP)，使MSU終濃度為500μmol/L，BZ-ATP終濃度為200μmol/L，總體積達(dá)500μl；然后置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；最后抽取各孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基并離心，提取培養(yǎng)液，-80℃冷凍保存。

1.4 細(xì)胞因子檢測 采用多重液相蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測細(xì)胞因子濃度。應(yīng)用Human Inflammatory Cytokines Kit(美國BD公司生產(chǎn)，貨號：551811)，實驗按照CBA技術(shù)操作步驟進(jìn)行，用PE標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體和樣本，在室溫下避光孵育3h，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，最后用CBA專用分析軟件FCAP Array v1.0進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及數(shù)據(jù)分析，即可得出細(xì)胞因子的濃度。

2 結(jié)果

2.1 單用MSU刺激外周血白細(xì)胞時，兩組培養(yǎng)液中不同細(xì)胞因子的濃度差異 單用MSU刺激時，痛風(fēng)與高尿酸血癥患者組比較，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 痛風(fēng)與高尿酸血癥患者外周血白細(xì)胞單用MSU刺激后分泌細(xì)胞因子的比較

2.2 MSU+ATP共同刺激外周血白細(xì)胞時，兩組培養(yǎng)液中不同細(xì)胞因子的濃度差異 用MSU+ATP共同刺激時，痛風(fēng)組培養(yǎng)液中IL-1β的水平較高尿酸血癥組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.081，P=0.037)；但兩組培養(yǎng)液中IL-6、IL-8和TNF-α的濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

表2 痛風(fēng)與高尿酸血癥患者外周血白細(xì)胞用MSU+ATP刺激后分泌細(xì)胞因子的比較

2.3 單用MSU與MSU+ATP分別刺激痛風(fēng)患者外周血白細(xì)胞時，培養(yǎng)液中不同細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較 痛風(fēng)患者組外周血白細(xì)胞單獨用MSU刺激與MSU+ATP共同刺激時,細(xì)胞培養(yǎng)液IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 痛風(fēng)患者外周血白細(xì)胞用MSU+ATP刺激較MSU單獨刺激時分泌細(xì)胞因子的比較

2.4 單用MSU與MSU+ATP分別刺激高尿酸血癥患者外周血白細(xì)胞時，培養(yǎng)液中不同細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較 高尿酸血癥患者外周血白細(xì)胞單獨用MSU刺激與MSU+ATP共同刺激時,細(xì)胞培養(yǎng)液IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 高尿酸血癥患者外周血白細(xì)胞用MSU+ATP刺激較MSU單獨刺激時分泌細(xì)胞因子的比較

3 討論

本研究結(jié)果顯示僅用MSU刺激痛風(fēng)和高尿酸血癥患者的外周白細(xì)胞分泌的IL-1β水平無顯著差異，提示促使痛風(fēng)的急性發(fā)作的致病因素可能不僅僅只是MSU；而當(dāng)用MSU和ATP共同刺激時，痛風(fēng)患者較高尿酸血癥患者外周白細(xì)胞分泌IL-1β的能力增加，不僅如此，痛風(fēng)患者外周白細(xì)胞會分泌更高水平的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，這提示著ATP參與了痛風(fēng)的發(fā)病，可能是引起急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要信號。

盡管MSU-NALP3-IL-1β信號通路參與了痛風(fēng)發(fā)病，IL-1β理論上是啟動痛風(fēng)發(fā)作的主要細(xì)胞因子[2]，但尚沒有直接證據(jù)予以證實。IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等多種細(xì)胞因子均參與了痛風(fēng)的發(fā)病機制:在痛風(fēng)病情活動時IL-6水平升高，也被認(rèn)為是啟動痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子之一[5]；在痛風(fēng)炎癥中TNF-α顯著升高，進(jìn)而能促進(jìn)IL-1β表達(dá)[6]；且IL-8是一種趨化性細(xì)胞因子，能夠趨化并激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的溶酶體酶活性和吞噬作用，而在痛風(fēng)炎癥過程中，中性粒細(xì)胞浸潤是其主要病理表現(xiàn)，亦有研究顯示在痛風(fēng)發(fā)作期IL-8血清水平顯著升高[7]。盡管IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8都參與了痛風(fēng)的發(fā)病，但尚不明確是否都參與了該病炎癥反應(yīng)的啟動。

由于單獨MSU并不能引起痛風(fēng)發(fā)病，因此難以在體外探尋啟動痛風(fēng)炎癥的細(xì)胞因子。在我們前期研究提出并證實了ATP和MSU協(xié)同作用下誘導(dǎo)了痛風(fēng)發(fā)作，特別是ATP受體P2X7的功能決定了痛風(fēng)的發(fā)病[3]，而ATP能通過刺激單核細(xì)胞表面P2X7R誘導(dǎo)IL-1β分泌。因此本研究在體外采用ATP和MSU協(xié)同刺激痛風(fēng)和高尿酸血癥患者的外周血白細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平顯著升高，而IL-6、IL-8和TNF-α水平變化在兩組中沒有顯著差異；且單用MSU刺激時，兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子均沒有差異。以上結(jié)果提示當(dāng)高尿酸血癥患者對ATP刺激反應(yīng)性更強、誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β更多時，才會引起痛風(fēng)發(fā)作，進(jìn)一步驗證了ATP是痛風(fēng)發(fā)作的第二致病信號，IL-1β是痛風(fēng)發(fā)作的主要細(xì)胞因子。

在痛風(fēng)炎癥啟動階段IL-1β水平升高后，IL-1β可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集啟動炎癥反應(yīng)，并且在MSU誘導(dǎo)炎癥的小鼠模型中，IL-1抑制劑可以阻止MSU誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤，但TNF抑制劑沒有此作用[8]，提示痛風(fēng)炎癥啟動階段的中性粒細(xì)胞浸潤與IL-1β直接相關(guān)。IL-1β還可以通過炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子產(chǎn)生并啟動炎癥反應(yīng)，對啟動急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作發(fā)揮重要作用；IL-1β可以上調(diào)TNF-α表達(dá)，二者可以進(jìn)一步通過不同途徑誘導(dǎo)IL-6和IL-8分泌[9]，引起炎癥加劇、痛風(fēng)病情活動。IL-6、TNF-α等其他炎性細(xì)胞因子盡管是繼發(fā)于IL-1β產(chǎn)生的，但在痛風(fēng)病情活動也發(fā)揮著重要作用，因此在臨床上，當(dāng)痛風(fēng)病情活動的患者使用TNF抑制劑或IL-6抑制劑治療時也是有效的[10-11]，提示這些細(xì)胞因子對痛風(fēng)病情活動的不可或缺作用。

事實上在痛風(fēng)炎癥的發(fā)展階段，繼發(fā)于IL-1β產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子的作用可能更為重要。因為當(dāng)炎癥一旦啟動后，會造成機體組織的缺氧，組織缺氧會增加CD39和CD73的活性[12]，而CD39可將ATP轉(zhuǎn)化成ADP和AMP，AMP又可以被CD73進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成腺苷[13]，腺苷與ATP作用相反，它可以通過刺激P1受體來抑制IL-1β釋放[14]，因此在痛風(fēng)炎癥發(fā)展期，IL-1β水平并沒有升高[5，7]，IL-1β不是致炎的主要細(xì)胞因子。目前臨床應(yīng)用的三個IL-1β抑制劑anakinra、rilonacept 和 canakinumab均可以顯著抑制痛風(fēng)發(fā)作[15-17]。因此本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β是啟動痛風(fēng)發(fā)作的炎性細(xì)胞因子，IL-1β抑制劑治療痛風(fēng)的重點不在于抗炎，而在于預(yù)防痛風(fēng)復(fù)發(fā)，這將有助于臨床醫(yī)師合理、正確地應(yīng)用IL-1β抑制劑。