TNF-α和TGF-β1基因多態(tài)性與關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解的相關(guān)性分析*

吳國(guó)忠 王文懷 黃 隆 方凱彬 施勁楠

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，福建省泉州市 362000

人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)非常重要且已發(fā)展成熟的外科技術(shù)，但人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后10年仍約有10%患者會(huì)出現(xiàn)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解現(xiàn)象。目前病因尚不明確，文獻(xiàn)報(bào)道導(dǎo)致人工髖關(guān)節(jié)松動(dòng)的原因大致可分為機(jī)械因素和生物學(xué)因素兩大類。機(jī)械因素包括：假體設(shè)計(jì)、術(shù)中操作、應(yīng)力遮擋等；生物學(xué)因素主要包括：假體材料及其產(chǎn)生的磨損顆粒所引起的無菌性炎性反應(yīng)。磨損顆粒誘發(fā)假體周圍組織產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)是導(dǎo)致假體周圍骨溶解、假體無菌性松動(dòng)的主要原因，但機(jī)制目前還未明確。大部分關(guān)節(jié)假體可長(zhǎng)期生存，但相同使用年限，不同個(gè)體發(fā)生骨溶解程度及概率并不相同，嚴(yán)重程度也差別明顯。除了年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、活動(dòng)水平、生化代謝差異對(duì)關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體無菌性松動(dòng)、骨溶解存在影響外，個(gè)體的遺傳因素在磨損顆粒引發(fā)的慢性炎癥識(shí)別、反應(yīng)也具有差異性。已有的研究證實(shí)多種基因單核苷酸多態(tài)性，不同基因表型與假體松動(dòng)、假體周圍骨溶解相關(guān)，說明不同的基因表型在磨損顆粒導(dǎo)致骨溶解的炎癥反應(yīng)存在差異性，不過目前這些研究的對(duì)象均為歐洲高加索人種且樣本量較小，缺乏有關(guān)亞洲及中國(guó)人群的研究。巨噬細(xì)胞吞噬磨損顆粒，釋放多種細(xì)胞因子，引起一系列炎癥反應(yīng)，其中TNF、TGF作為炎癥因子，在炎癥免疫中起著重要作用，但由于個(gè)體之間對(duì)聚乙烯磨損顆粒的反應(yīng)存在很大差異[1]，只有少部分患者發(fā)生假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解。這種個(gè)體差異是否與TNF-α、TGF-β1基因多態(tài)性相關(guān)，目前尚不明確。為此筆者采用病例對(duì)照回顧性分析研究的方法，探討了TNF-α基因238 G/A位點(diǎn)[2]、TGF-β1基因+869T/C、+915G/C位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性[3]與人工髖關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解是否存在相關(guān)性。現(xiàn)將研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年8月1日—2020年12月31日在我院隨訪到的人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動(dòng)、假體周圍骨溶解患者共20例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床癥狀、體格檢查及影像學(xué)檢查綜合評(píng)估，符合髖關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解診斷標(biāo)準(zhǔn)[4-6];(2)均自愿參加本次研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)假體周圍感染導(dǎo)致的假體松動(dòng)病例；(2)不愿參加研究。同期另取我院髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后隨訪5年以上，并且假體牢固的患者30例作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均為福建地區(qū)漢族人，其職業(yè)、文化程度不限。兩組患者的一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。本研究方案獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有入院患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者的一般情況比較

1.2 儀器及試劑 本研究采用下列儀器及試劑：高速低溫離心機(jī)(5840R，Sigma公司)；T100 PCR儀(BIO-RAD公司)；全自動(dòng)凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；水平電泳裝置(北京市六一儀器廠)；JA-2003電子分析天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；海爾MI-2270M(N)微波爐(青島海爾集團(tuán))；微量紫外—可見光分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)，Agarose，GelStain，DNA Loading buffer，Trans2K DNA Marker(北京全式金有限公司)；血液基因組 DNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；無水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.3.1 提取基因組：抽取患者外周靜脈血2ml，置入含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的真空無菌管中混勻，-80℃保存?zhèn)溆?。參照說明書用血液基因組DNA 提取試劑盒提取基因組。(1)將-80℃凍結(jié)的樣品拿出后，室溫解凍。(2)加20μl Protein K，500μl BB3及10μl Rnase A于2ml 的樣品中，渦旋15s混合均勻，室溫孵育10min。(3)短暫離心，將全部的溶液加入離心柱中，12 000g離心1min，棄流出液。(4)加入500μl溶液CB3，12 000g離心30s，棄流出液。(5)加入500μl溶液WB3，12 000g離心30s，棄流出液。(6)再加入500μl溶液WB3，12 000g離心30s，棄流出液。(7)12 000g離心2min，徹底去除殘留的WB。(8)將離心柱置于一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，在柱的中央加入50～200μl預(yù)熱的EB(60～70℃)，室溫溫育1min，2 000×g離心1min，洗脫DNA。(9)提取的DNA可直接用于各種下游應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，如不立即使用，請(qǐng)于-20℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成：在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中找到TNF-α基因及TGF-β1基因序列。查詢TNF-α基因ID為7124，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物序列，TNF-α(238)設(shè)計(jì)上游為 5’-GCCCCTCCCAGTTCTAGTTC-3’，下游為 5’-TCATCTGGAGGAAGCGGTAG-3’，片段大小319bp。查詢TGF-β1基因ID為7040，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物序列，TGF-β1(869和915)上游為5’-GCATCCTAGACCCTTTCTCCTC-3’，下游為 5’-TGGCGTAGTAGTCGGCCTC-3’，片段大小621bp。

1.3.3 PCR技術(shù)：將提取的cDNA稀釋5倍作為PCR的模板，按2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)的說明書配制qPCR反應(yīng)液，總反應(yīng)體系20μl。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性2min；變性95℃ 20s，退火60℃ 20s，72℃ 15s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。使用T100 PCR儀，擴(kuò)增目的基因。根據(jù)引物設(shè)計(jì)及合成，得知TNF-α包含238位點(diǎn)的基因片段大小為319bp，TGF-β1包含+869和+915位點(diǎn)的基因片段大小為621bp。利用設(shè)計(jì)合成的引物成功擴(kuò)出了目的基因片段。

1.3.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序：一代測(cè)序Sanger法即雙脫氧末端終用做止法，對(duì)每個(gè)樣品的pCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，用DNAMAN8軟件分析比較DNA測(cè)序結(jié)果，確定觀察組及對(duì)照組樣本TNF-α(238G/A)，TGF-β1(+869T/C和+915G/C)3個(gè)基因位點(diǎn)的基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理所得數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

對(duì)TNF-α基因238G/A位點(diǎn)基因型分析，由于AA基因型理論數(shù)<1，采用Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，得出P>0.05，提示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為觀察組、對(duì)照組TNF-α基因238G/A位點(diǎn)基因型存在相關(guān)性。TGF-β1+869T/C、+915G/C兩個(gè)基因位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)SNP多態(tài)性。兩組基因型分布情況見表2。

表2 兩組基因型分布情況

3 討論

3.1 關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解的病因探討與處理 關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解是初次人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后失敗和翻修手術(shù)最常見的原因[7]，其病因尚不清楚。有研究認(rèn)為磨損顆粒在假體周圍無菌性松動(dòng)、骨溶解起到關(guān)鍵作用[8-9]。磨損顆粒通過吞噬作用或模式識(shí)別受體作用于巨噬細(xì)胞，引起多種趨化因子和炎性介質(zhì)釋放,啟動(dòng)骨質(zhì)溶解的進(jìn)程[10]。磨損顆粒引發(fā)的骨溶解本質(zhì)上是異物排斥反應(yīng)的一種。磨損顆粒被巨噬細(xì)胞吞噬后，產(chǎn)生一系列炎癥因子，誘導(dǎo)骨溶解及無菌性松動(dòng)，而大的顆粒雖不被吞噬，但能被巨噬細(xì)胞所包裹，同樣能刺激巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，引起炎癥反應(yīng)。要控制骨溶解現(xiàn)象，需減少磨損顆粒的產(chǎn)生及其生物學(xué)反應(yīng)。植入物設(shè)計(jì)、手術(shù)因素、患者因素均對(duì)磨損顆粒的形成造成影響。優(yōu)化設(shè)計(jì)和改良關(guān)節(jié)假體材料，提高耐磨性，規(guī)范手術(shù)操作，降低患者體重指數(shù)，避免關(guān)節(jié)置換術(shù)后過度使用，藥物治療，均是減少磨損顆粒的重要手段。

3.2 TNF-α、TGF-β1與關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解 有研究提出與骨關(guān)節(jié)炎患者不同，髖關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)患者局部有特殊的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)支配現(xiàn)象，提示神經(jīng)免疫相互作用，揭示潛在的作用機(jī)制及靶向治療手段，以改善髖關(guān)節(jié)假體的壽命和治療假體無菌性松動(dòng)[11]。炎癥細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β1是重要的影響骨代謝的因子，在假體周圍骨溶解的慢性炎性骨吸收發(fā)揮了重要作用。人類基因轉(zhuǎn)錄活性的升高或降低與該基因啟動(dòng)子中的SNP有關(guān)，蛋白質(zhì)編碼區(qū)的SNP可能會(huì)使其翻譯后關(guān)鍵的功能基團(tuán)氨基酸序列發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致人體對(duì)特定環(huán)境或病因的敏感性增加，從而致病。

TNF-α是一種主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌，且有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，廣泛參與誘導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)。啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)及基因水平的增加有關(guān)，在TNF-α啟動(dòng)子238位點(diǎn)等位堿基呈現(xiàn)多態(tài)性，有GG、GA、AA 3種不同基因型[12]。本研究中TNF-α 238觀察組 GG基因型18例，AA基因型2例，對(duì)照組30例基因型均為 GG，兩組基因型數(shù)據(jù)對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故不能認(rèn)為TNF-α 238單核苷酸多態(tài)性與關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解存在相關(guān)性，即還不能認(rèn)為TNF-α 238(G/A)位點(diǎn)AA基因型是關(guān)節(jié)假體松動(dòng)、周圍骨溶解的遺傳危險(xiǎn)因素。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)是一個(gè)多效的細(xì)胞因子，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，是重要的骨代謝調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生化與增殖，抑制破壞細(xì)胞前體的形成及骨吸收。該TGF-β1基因定位于染色體19q13，具有遺傳多態(tài)性，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，編碼區(qū)的基因多態(tài)性可引起編碼蛋白的差異，影響疾病的產(chǎn)生或嚴(yán)重程度。TGF-β1基因SNP的存在可能通過影響TGF-β1在血清中的表達(dá)量，影響假體周圍局部骨質(zhì)代謝，使骨細(xì)胞功能受損，引起假體周圍骨溶解、假體松動(dòng)的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1至少存在8個(gè)常見基因多態(tài)性位點(diǎn)，其中+869T/C以及+915G/C是研究較多的2個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)。TGF-β1在體內(nèi)產(chǎn)生量的多少可能與TGF-β1+869，+915位點(diǎn)的基因多態(tài)性相關(guān)[3]。但在本研究中觀察組及對(duì)照組TGF-β1基因+869 T/C位點(diǎn)均為CC基因型，在+915G/C位點(diǎn)均為GG基因型，暫未發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性，故不能認(rèn)為TGF-β1+869、+915位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、骨溶解發(fā)病存在相關(guān)性。

3.3 本研究的潛在價(jià)值 目前關(guān)節(jié)假體植入后骨溶解現(xiàn)象尚無有效的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，無法進(jìn)行早期干預(yù)治療，并且無法有效評(píng)估治療效果，故當(dāng)患者出現(xiàn)明顯松動(dòng)癥狀而就診時(shí)，通常原關(guān)節(jié)假體已無法保留，只能依靠翻修手術(shù)恢復(fù)關(guān)節(jié)功能。本研究目的討論分析TNF-α 238G/A、TGF-β1+869T/C、+915G/C共3個(gè)基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為其發(fā)病尋找危險(xiǎn)遺傳基因類型提供科學(xué)依據(jù)，當(dāng)相關(guān)危險(xiǎn)易感基因明確后，可早期預(yù)警，提前藥物介入或在基因個(gè)體化治療提供新思路，應(yīng)用價(jià)值巨大。

在關(guān)節(jié)假體植入術(shù)前，檢測(cè)關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解發(fā)病相關(guān)的危險(xiǎn)遺傳基因類型，提前干預(yù)，降低宿主對(duì)磨損顆粒的慢性炎癥反應(yīng)。如可通過選擇特殊類型關(guān)節(jié)假體，有文獻(xiàn)用地塞米松作為抗炎藥物洗脫的人工關(guān)節(jié)種植系統(tǒng)相關(guān)研究，以防止磨損顆粒引起的假體周圍骨溶解[13]，或選用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2特殊涂層的股骨柄假體以降低假體松動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)[14]。對(duì)已經(jīng)行人工關(guān)節(jié)置換的患者，檢測(cè)相關(guān)危險(xiǎn)遺傳基因類型，對(duì)具有危險(xiǎn)因素患者可提前藥物介入處理，通過抑制骨吸收、促進(jìn)骨生成和抑制炎癥反應(yīng)，可選擇雙膦酸鹽類藥物、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、他汀類藥物、TNF-α拮抗劑及環(huán)氧化酶抑制劑等。已有文獻(xiàn)報(bào)道基因治療的相關(guān)研究，由慢病毒介導(dǎo)的靶向TNF-α基因的shRNA基因治療可能為無菌性關(guān)節(jié)松動(dòng)提供一種新的治療方法[15]。

3.4 本研究的局限性及改進(jìn)方向 本研究具有一定的局限性，樣本量小，只限于福建地區(qū)漢族人群，僅探討了觀察組與對(duì)照組TNF-α 238、TGF-β1基因+869、+915共3個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，本實(shí)驗(yàn)沒有涉及觀察組與對(duì)照組中患者TNF-α、TGF-β1的分子表達(dá)水平差異，也沒有涉及兩組患者免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)差異。因此，該研究需要增加樣本量，增加不同地區(qū)人群，擴(kuò)大基因檢測(cè)位點(diǎn)，并對(duì)關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解發(fā)病與易感基因型是否相關(guān)，在分子表達(dá)水平、細(xì)胞反應(yīng)水平上作更深入研究。目前本研究結(jié)果尚不能認(rèn)為這3個(gè)基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解發(fā)病存在相關(guān)性，因?yàn)橛绊戧P(guān)節(jié)假體長(zhǎng)期生存的遺傳因素可能有多種基因參與，最終結(jié)果可能是由多種基因參與的結(jié)果，文獻(xiàn)報(bào)道假體周圍骨質(zhì)溶解的個(gè)體差異性可能與IL-1RA基因、IL-6基因、基質(zhì)金屬蛋白酶—基因的單核苷酸多態(tài)性有關(guān)[10]。但目前由于人力、研究經(jīng)費(fèi)的限制，進(jìn)一步開展此類相關(guān)研究難度較大。

綜上所述，目前尚不能認(rèn)為TNF-α 238、TGF-β1+869、+915位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)、假體周圍骨溶解發(fā)病存在相關(guān)性，其發(fā)病可能潛在易感基因有待進(jìn)一步深入研究明確。