RASSF4基因啟動子甲基化與腫瘤關系的研究進展

閆亞楠，陳興珍，周策凡，唐景峰

(1.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學 國家外專局/教育部細胞調控與分子藥物“111”引智基地，武漢 430068)

在腫瘤形成過程中，通過檢測基因組結構本身的變化，包括基因突變和染色體異常等，進而發(fā)現(xiàn)影響腫瘤發(fā)生發(fā)展及其相關指標改變的可能原因。此外，許多表觀基因組的變化，如基因甲基化狀態(tài)的改變，也與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)提供的甲基被轉移到相應堿基的一種DNA共價修飾方式[2]。在人類細胞基因組中DNA主要的甲基化修飾方式是CpG二核苷酸的第5位胞嘧啶處接受甲基，其中CpG二核苷酸高度聚集的DNA部位稱為CpG島，并且約有50%的啟動子區(qū)域含有CpG島[3]。但在惡性轉化細胞的基因組中，約5%～10%基因啟動子CpG島的甲基化會異常增加，使得腫瘤相關基因異常表達，促使腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。

Ras蛋白是GDP/GTP分子開關蛋白，通常以GTP結合的激活狀態(tài)或GDP結合的惰性狀態(tài)存在，Ras可與下游效應蛋白相互作用，通過復雜的信號級聯(lián)，促發(fā)細胞增殖、分化、運動和凋亡等多種細胞活動[5]。Ras蛋白及其下游效應因子的異常突變可激活超過30%的腫瘤發(fā)生[6]。Vavvas等[7]利用酵母雙雜交技術以Ras作為誘餌，可在體外與小鼠細胞中RASSF5發(fā)生相互作用。Dammann等[8]在以人類DNA切除修復蛋白XPA誘餌的酵母雙雜交篩選中發(fā)現(xiàn)RASSF1，與RASSF5具有高度同源性，并確定了RASSF13個不同的轉錄本都可編碼Ras相關域(Ras-association domain, RA)。隨后包含有10個成員(RASSF1～RASSF10)的Ras相關域家族(Ras-association domain family, RASSF)被發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)RA結構域分布位置的不同，分為兩個子類別：C端RASSF(RASSF1～6)和N端RASSF(RASSF7～10)，部分成員的基因啟動子甲基化與相關腫瘤關系的研究與總結已較為全面[9-10]。RASSF4在許多研究中發(fā)現(xiàn)其在正常組織中高表達，而在腫瘤中被甲基化而表達下調，是一種候選的腫瘤抑制因子[11]。但RASSF4啟動子甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關聯(lián)及意義尚未明晰，故重點對RASSF4啟動子甲基化與腫瘤關系的研究進展進行綜述。

1 RASSF4生物學概況

1.1 RASSF4分子結構

RASSF4基因位于人類染色體10q11.21處，其啟動子處有一個CpG島[6,10-11]。有文獻報道，RASSF4經(jīng)數(shù)據(jù)庫預測，可選擇性剪接產(chǎn)生6個能翻譯成蛋白質的轉錄本：RASSF4A～RASSF4F，其CpG島跨越了第一個非編碼的外顯子(圖1)[6]。其中，RASSF4A共含11個外顯子，可翻譯為一個321氨基酸的蛋白質[6]。RASSF4B和RASSF4C與RASSF4A相似，不同之處在于它們N端外顯子的差異，RASSF4D、RASSF4E和RASSF4F的轉錄本由于第5號外顯子被截斷而變短(圖1)[6]。目前針對RASSF4A及其蛋白功能的報道較為全面，因此本文主要討論RASSF4A啟動子甲基化與腫瘤的關系。

圖1 RASSF4基因位點預測6個轉錄本解析圖(改自文獻[7])

RASSF4蛋白，也稱為AD037，大小為36.7 ku，其位于175～262氨基酸的RA結構域能以GTP依賴性方式直接與激活的K-Ras結合，從而展現(xiàn)作為Ras效應器的基本功能(圖2)[9-11]。RASSF4還包含了270～317氨基酸的SARAH(Salvador-RASSF-Hippo)結構域，該結構域可介導RASSF4自身或與其他蛋白質的二聚化效應[9-10]，例如：RASSF4可與同樣包含SARAH結構域的哺乳動物Ste20樣激酶1(Mammalian Ste20-like kinase 1, MST1)發(fā)生相互作用，而MST1與腫瘤抑制、凋亡和Hippo信號級聯(lián)相關(圖2)[10,12]。RASSF4與RASSF1A的同源性為25%，與RASSF2的同源性高達60%[11]。同時，RASSF4缺少一些RASSF部分成員共有的特殊結構域，如：位于RASSF1A和RASSF5A中N端保守的，含鋅指結構的半胱氨酸結構域(Cysteine-rich diacylglycerol/phorbol ester, DAG)，也稱為蛋白激酶C保守區(qū)1(Protein kinase C conserved region 1, C1)和位于RASSF1A中RA結構域前部，具有調控細胞周期檢查點的ATM(Ataxia telangiectasia mutated)激酶域[6,10]。

圖 2 RASSF4蛋白結構域分布圖

1.2 RASSF4生物學功能及機制

1.2.1 RASSF4與細胞增殖

Michifuri等[13]發(fā)現(xiàn)脯氨酸豐富的小蛋白-1B(Small proline-rich protein-1B, SPRR1B)在人口腔鱗狀細胞癌干細胞中高表達后抑制了RASSF4表達量，進而激活MAP激酶級聯(lián)信號來促進該細胞增殖。相反的是，有團隊發(fā)現(xiàn)在腺泡狀橫紋肌肉瘤細胞中可上調RASSF4，而后與MST1結合抑制MST1磷酸化，進而抑制銜接蛋白Mob激酶活化劑1(Mob kinase activator 1, MOB1)磷酸化，促進該細胞增殖[14]。這提示RASSF4在不同細胞類型中增殖的作用可能有所不同。

1.2.2 RASSF4與細胞分化

Lin等[15]報告RASSF4是一種新的中心體蛋白，是人類骨骼肌成肌細胞分化的關鍵成分。在分化肌管的過程中，成肌細胞通過RASSF4與MST1相結合從而促進分化，但MST1的高表達可以逆轉已敲除RASSF4的成肌細胞分化，說明RASSF4與MST1協(xié)同支持骨骼肌細胞的分化。

1.2.3 RASSF4與細胞凋亡

Eckfeld等[11]報道了RASSF4過表達能夠誘導293T細胞Ras依賴性凋亡，同時可以激活凋亡相關蛋白Caspase來抑制腫瘤細胞的生長。并且，該團隊利用一種可以激活Ras效應器的方法，即在Ras的C端定點克隆膜定位序列CAAX(C是半胱氨酸，A通常是脂肪族氨基酸，X是任何氨基酸)，然后在RASSF4的C端加入Ras-CAAX膜定位信號，發(fā)現(xiàn)RASSF4進一步增強促細胞凋亡的能力，同時發(fā)現(xiàn)RASSF4與MST1協(xié)同促進凋亡的發(fā)生。有報道，RASSF4高表達能夠結合和激活MST1，進而導致JNK/c-Jun途徑激活、組蛋白H2AX和H2B磷酸化增加和染色質濃縮，最終促使MM細胞凋亡[16]。

1.2.4 RASSF4其他生物學功能

最近研究表明，RASSF4具有其他潛在功能。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)RASSF4可結合和活化腺苷二磷酸核糖基化因子6(Adenosine diphosphate ribosylation factor 6, ARF6)，激活I型磷脂酰肌醇磷酸5-激酶(Type I phosphatidylinositol phosphate 5-kinases, PIP5KIs)，提高磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PI(4,5)P2)水平，進而調控鈣庫操作性鈣離子通道(Store-operated calcium entry, SOCE)，即促使內質網(wǎng)Ca2+傳感器基質相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1, STIM1)向內質網(wǎng)-質膜(ER-PM)轉運，觸發(fā)Ca2+內流，并對ER-PM的連接起著穩(wěn)定作用，這提示RASSF4可調控SOCE、ER-PM連接和PI(4,5)P2所依賴的生物學過程。Zhang等[18]報道了在骨肉瘤細胞中過表達RASSF4可降低Wnt信號通路相關蛋白β-Catenin及其下游靶蛋白cyclin D1和c-Myc的表達，故推測RASSF4與Wnt信號通路存在某種聯(lián)系。

2 RASSF4基因啟動子甲基化與腫瘤的關系

2.1 RASSF4在腫瘤中的表達失調機制

腫瘤相關基因組結構異常和表觀基因組改變是由遺傳因素引起腫瘤發(fā)生的主要作用機制[1]。研究人員沒有檢測到RASSF4編碼序列潛在失活突變位點，卻發(fā)現(xiàn)RASSF4在人體組織(腦、心、肝、肺、胰腺、骨骼肌和胎盤)中廣泛表達，但在某些腫瘤細胞系和原發(fā)腫瘤中被下調[11]。經(jīng)研究，RASSF4啟動子有一個CpG島，其表達水平與CpG島甲基化相關，如果用DNA去甲基化劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-CdR)處理某些腫瘤細胞后甲基化發(fā)生逆轉[10-11]。故表明RASSF4在多種腫瘤的重要失調機制是其啟動子甲基化，但其甲基化的程度因腫瘤細胞類型的不同而有所差異。

2.2 RASSF4啟動子甲基化與RCC、BC和CRC

Eckfeld等[11]通過檢測CpG島甲基化，發(fā)現(xiàn)在正常腎細胞中RASSF4高表達，在不發(fā)生RASSF4甲基化的RCC細胞系SKRC54與正常腎細胞相比，RASSF4表達量高達58.4%，但存在RASSF4甲基化的SKRC18和SKRC39系與正常腎細胞相比，表達量僅為4.5%和1.1%。在RCC細胞中，RASSF4啟動子甲基化率為44.4%(4/9)。同時發(fā)現(xiàn)，存在RASSF4甲基化的T375系的原代BC細胞、T47D、HCC1419、MCF-7和HTB19的BC細胞系中，其表達量僅為正常乳腺細胞的12.8%、3.4%、1.4%、0.3%和0.3%;在BC的原代細胞和腫瘤細胞系樣本中，RASSF4甲基化率分別為27.0%(10/37)和53.6%(15/28)[11]。經(jīng)5-Aza-CdR處理，T74D和MCF-7中RASSF4表達量增加。研究表明在CRC細胞系SW48和DLD1中RASSF4甲基化程度高，5-Aza-CdR處理后，SW48和LoVo系相比未處理組的RASSF4的轉錄水平增加[11]。以上表明RASSF4在RCC、BC和CRC中可作為潛在抑癌因子。

2.3 RASSF4啟動子甲基化與LC

Eckfeld等[11]發(fā)現(xiàn)，在正常的肺細胞中，RASSF4轉錄水平高達54.1%，但在有甲基化RASSF4的癌細胞系A549和H2171中，其轉錄水平低至9.9%和1.5%。在原發(fā)性小細胞肺癌(Primary small-cell lung carcinoma, SCLC)的原代細胞和腫瘤細胞系樣本中，RASSF4啟動子甲基化率分別為20.7%(6/29)和32.0%(8/25)。在非小細胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC)的原代細胞和腫瘤細胞系樣本中，RASSF4啟動子甲基化率分別為22.2%(6/27)和50.0%(7/14)。同樣有文獻指出約有40.5%(36/89)的NSCLC樣本與正常肺細胞相比，RASSF4表達量下降，并且在NSCLC中H460、A549、H1299和H446系，RASSF4表達量明顯降低，并且該團隊推測由于RASSF4啟動子甲基化而導致RASSF4表達量降低[19-20]。Liu等[21]發(fā)現(xiàn)在肺腺癌(Lung adenocarcinoma, LUAD)中，高甲基化/高miRNA表達組的RASSF4蛋白水平要明顯低于低甲基化/低miRNA表達組，同時發(fā)現(xiàn)低表達的RASSF4會影響LUAD的預后。故這些研究表明在肺癌中RASSF4因甲基化而表觀下調，RASSF4可作為肺癌潛在的抑癌因子。

2.4 RASSF4啟動子甲基化與MM

De Smedt等[16]報道了在MM中XG-7、AMO-1和L363系的RASSF4表達水平較低，并且RASSF4表達量與CpG島的甲基化狀態(tài)呈顯著反比(R=-0.89)。用5-Aza-CdR處理XG-7和AMO-1，RASSF4顯著上調。在自發(fā)發(fā)育成原代MM的小鼠模型中，通過抗癌藥物治療可顯著地增強RASSF4表達量，這說明過表達RASSF4可抑制MM在體內的生長，表明RASSF4可作為抑制MM生長的中樞。

2.5 RASSF4啟動子甲基化與HNSCC

Steinmann等[22]發(fā)現(xiàn)，在HNSCC中RASSF4可發(fā)生甲基化；在原發(fā)性HNSCC患者中，只有13.0%(7/54)患者的RASSF4發(fā)生甲基化。但是復發(fā)性HNSCC患者(23.3%,7/30)的RASSF4甲基化程度高于未復發(fā)患者(0%,0/20)。在第Ⅳ期的HNSCC，有17.1%(6/35)的患者中發(fā)生RASSF4甲基化，明顯高于處于第Ⅲ期患者的RASSF4甲基化水平(0%,0/7)。同時，在N3期中發(fā)現(xiàn)RASSF4甲基化的程度達50.0%(3/6)，要比N2期HNSCC(11.5%,3/26)的甲基化程度高。這說明在復發(fā)的HNSCC、Ⅳ期和N3期的HNSCC中，有較高的RASSF4甲基化水平，RASSF4可作為HNSCC中潛在抑癌因子。

2.6 RASSF4啟動子甲基化與GCA

Guo等[23]提出，在GCA的組織樣本中，有51.9%(70/135)的樣本顯示出RASSF4表達量下降。同時，在GCA樣本中檢測到RASSF4的異常CpG島甲基化，并與RASSF4表達量呈負相關(R=-0.296)。這提示RASSF4可能是GCA腫瘤發(fā)生的抑癌因子之一。

2.7 RASSF4啟動子甲基化與NPC

Chow等[24]發(fā)現(xiàn)通過對RASSF4在NPC各細胞系中轉錄水平的檢測，在CNE1、CNE2和HONE1系中明顯降低，而在具有良好分化能力的HK1系中RASSF4表達缺失。通過檢測CpG島甲基化，在HK1中檢測到RASSF4啟動子區(qū)呈密集甲基化，而其他系則未顯甲基化。用5-Aza-CdR處理HK1，觀察到RASSF4發(fā)生去甲基化和再表達。但在檢測原發(fā)性NPC中RASSF4甲基化狀態(tài)時，發(fā)現(xiàn)只有5.0%(1/20)的樣本中檢測到。由于RASSF4高甲基化僅存在于HK1，故該團隊推測RASSF4在分化程度較高的NPC癌系中甲基化頻率高，具有癌細胞系特異性。據(jù)此推測RASSF4可能是HK1等分化程度良好的癌細胞系潛在抑癌靶點之一，但并非抑制NPC的關鍵靶點。

2.8 RASSF4啟動子甲基化與其他腫瘤

Djos等[25]發(fā)現(xiàn)在所有的神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma,NB)系中，均表達RASSF4，并且與RASSF其他成員相比，RASSF4表達水平最高。而且在NB中RASSF4甲基化水平低于25%，在原發(fā)性NB中一般不發(fā)生甲基化。同時該團隊用5-Aza-CdR和去乙酰化酶抑制劑TSA聯(lián)合處理可導致5/9的細胞中RASSF4的轉錄水平上調，表明RASSF4在NB中可發(fā)生表觀遺傳調控。但由于在不同的NB細胞系中均表達RASSF4，并且在NB中RASSF4低甲基化，所以該團隊認為RASSF4不作為NB中的候選抑癌基因。有文獻報道了在膀胱癌(Bladder cancer, BCa)及其鄰近正常組織中均未發(fā)現(xiàn)RASSF4發(fā)生甲基化[26]。Richter等[27]通過檢測RASSF4在嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma, PCC)中的甲基化程度，發(fā)現(xiàn)沒有樣本(0/19)顯示其啟動子區(qū)呈甲基化。有團隊在甲狀腺癌(Thyroid cancer, TC)細胞中未檢測到甲基化的RASSF4[28]。Calvisi等[29]發(fā)現(xiàn)在正常肝臟中RASSF4的啟動子不發(fā)生甲基化，在肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)中RASSF4甲基化率為5%，其甲基化程度較低。故依據(jù)上述研究結果推測，RASSF4在NB、BCa、PCC、TC和HCC中作為候選、關鍵抑癌因子的可能性較小。但上述部分腫瘤的相關報道并不多，對此可進一步驗證與研究。

3 逆轉甲基化治療腫瘤

由于DNA甲基化不會造成一級結構的改變，具有可逆性[2,30]。故可根據(jù)該特點，尋找可使抑癌基因去甲基化的藥物，恢復抑癌蛋白在特定腫瘤的表達，為治療腫瘤提供一種可行性。5-Aza-CdR又名地西他濱，作為一種常用有效但毒性較高的去甲基化劑，已被美國食品和藥物管理局(FDA)獲批上市，用于治療由骨髓增生異常引起的綜合癥和惡性血液病[30]。經(jīng)5-Aza-CdR處理的DNA鏈可共價結合于DNMTs，從而降低DNMTs酶活，這樣存在于腫瘤細胞的相關抑癌因子免于甲基化，進而重新活化表達起到抑癌作用[30]。在上述研究中，BC[11]、CRC[11]、MM[16]、NPC[24]和NB[25]中的部分腫瘤系經(jīng)5-Aza-CdR處理甲基化的RASSF4后可重新表達。但由于5-Aza-CdR的大劑量使用引發(fā)細胞毒害，故5-Aza-CdR和相關表觀遺傳修飾藥劑的聯(lián)合使用以提高藥效，已成為研究熱點[30]。此外，鳥苷地西他濱、折不拉林等DNA去甲基化劑已有條不紊地開發(fā)和臨床實驗[30]。所以，通過合理找尋和使用去甲基化劑藥物，逆轉RASSF4等相關抑癌基因的甲基化，以治療特定腫瘤仍需深入探究。

4 總結與展望

據(jù)文獻報道，RASSF4基因經(jīng)預測后有6個轉錄本，目前研究較為全面的是RASSF4A及其蛋白，而其他轉錄本及對應蛋白的相關研究還有待確認與開展。并且，RASSF4作為一種潛在的腫瘤抑制因子，可調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等多種生理活動，但調控機制復雜，還需深入研究。RASSF4在RCC、BC、CRC、LC、MM、HNSCC、GCA和NPC(尤其是HK1等分化程度良好的癌系)的腫瘤中下調或沉默，其中啟動子CpG島異常甲基化是其表達下調或沉默的主要機制，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。但已研究的部分腫瘤與RASSF4啟動子甲基化關系的相關報道并不多，對此可加以驗證與深入研究，同時可為研究工作者探究RASSF4啟動子甲基化與目前未研究的腫瘤的相關性提供思路。此外，伴隨著研究的不斷深入，RASSF4異常甲基化檢測有望成為特定腫瘤檢測的輔助手段，對逆轉RASSF4及其他相關抑癌基因甲基化合適藥物的尋找也有望作為治療特定腫瘤的新方法?？傊S著更加深入地解析RASSF4因子，將為特定腫瘤的檢測和治療提供可行性。