大口黑鱸源維氏氣單胞菌的分離鑒定

楊 超，董浚鍵，劉志剛，孫成飛，趙 飛，葉 星

（1.上海海洋大學/農業(yè)農村部淡水水產種質資源重點實驗室/水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2.中國水產科學研究院珠江水產研究所/農業(yè)農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室/廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380）

大口黑鱸 (Micropterus salmoides) 隸屬鱸形目、太陽魚科、黑鱸屬，原產于北美洲，于1983年從中國臺灣引入廣東省。大口黑鱸適溫能力較強，生長速度快且易捕撈，肉質較好、無肌間刺，深受消費者歡迎。由于大口黑鱸配合飼料的突破，養(yǎng)殖規(guī)模進一步擴大[1-3]。據2020中國漁業(yè)統計年鑒，2019年我國養(yǎng)殖大口黑鱸年產量已達47.8萬噸[4]。但近年來，我國大口黑鱸育苗期與成魚養(yǎng)殖期病害頻發(fā)，尤其是細菌與病毒性疾病使其養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大損失。

維氏氣單胞菌 (Aeromonas veronii) 隸屬弧菌科、氣單胞菌屬，是重要的人、獸及水生生物共患病原菌[5]。其廣泛存在于環(huán)境中，尤其是水體環(huán)境，夏、秋兩季最有利于其增殖，在水生生物個體免疫力低下或體表有創(chuàng)傷的情況下更容易感染該菌，暴發(fā)時可造成較高的死亡率[5-7]，如2014年8月四川雅安某水庫養(yǎng)殖大口黑鱸出現大面積死亡，死亡率高達60%[5]。 已發(fā)現該菌感染導致多種水產養(yǎng)殖動物發(fā)病，如烏鱧 (Channa argus)、大黃魚 (Pseudosciaena crocea)、斑點叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)、克氏原螯蝦 (Procambarus clarkii)、虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)、鯽 (Carassius auratus gibelio)、泥鰍 (Misgurnus anguillicaudatu)、尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus)、青蝦 (Macrobrachium nipponense)、錦鯉 (Cyprinus carpio) 和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco) 等[8-15]。魚類感染維氏氣單胞菌的典型癥狀為魚體潰爛出血，肝臟、脾臟腫大及腎臟充血等。

維氏氣單胞菌包括2個生物型，即維氏氣單胞菌維羅納生物型 (A.veroniibv.veronii) 與維氏氣單胞菌溫和生物型 (A.veroniibv.sobria)[16]。在魚類中也發(fā)現有維氏氣單胞菌的不同生物型。在尼羅羅非魚上發(fā)現維氏氣單胞菌溫和生物型的感染[17]，在烏鱧、尼羅羅非魚上發(fā)現維氏氣單胞菌維羅納生物型感染[6,18]。近年大口黑鱸也有被維氏氣單胞菌感染導致暴發(fā)性死亡的相關報道，且其苗種和成魚均可被感染[19-22]，但均未進一步鑒定其具體屬于哪個生物型。

為查明引起2020年春季廣東省佛山市某育苗場大口黑鱸魚苗暴發(fā)性死亡的病原菌，本研究對采集的大口黑鱸發(fā)病樣本開展了細菌分離與攻毒、分子與生理生化鑒定和藥物敏感性等實驗，為大口黑鱸苗種的病害防控及疫苗研制提供了科學依據，也為區(qū)分維氏氣單胞菌生物型提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

發(fā)病大口黑鱸樣本采自廣東佛山某鱸魚苗種場，體質量約 (10±2) g。健康大口黑鱸魚苗由廣州愛漁公司提供，體質量約 (20±5) g。用于攻毒實驗的健康大口黑鱸魚苗在攻毒前檢測脾腎綜合癥病毒與蛙病毒攜帶情況，結果均為陰性。

腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基 (BHI)、七葉苷、精氨酸雙水解酶及無菌液體石蠟均購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司。RS瓊脂、羊血瓊脂平板購自廣州勤卓生物科技有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司。藥敏實驗所用的抗菌藥物購自杭州微生物試劑有限公司。PCR儀為BIOER公司產品。PCR反應體系產品購自TaKaRa公司。VITEK2全自動細菌鑒定系統為梅里埃公司產品。其他試劑均為國產分析純。

1.2 細菌分離與培養(yǎng)

發(fā)病大口黑鱸的主要癥狀為肝脾腫大、腎臟出血、體表鱗片脫落及出血?，F場用75%乙醇棉球對病魚體表進行消毒，無菌操作從肝臟取樣，劃線接種血瓊脂平板。實驗室28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，獲得純化菌株用于人工感染實驗以及分子鑒定。

1.3 生理生化鑒定

取在RS平板上培養(yǎng)24 h的菌體，使用梅里埃公司的VITEK2全自動細菌鑒定系統進行分析。同時根據伯杰氏細菌分類手冊[14]，設置補充理化實驗，包括精氨酸雙水解酶、七葉苷、羊血瓊脂溶血實驗，對分離菌株做進一步的理化鑒定。

1.4 分子鑒定

參照文獻[23]分別合成擴增16S rRNA的通用引物和擴增gyrB的特異性引物。預期擴增片段長度分別為1 465和1 130 bp。16S rRNA上、下游引物序列分別為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和TACGGCTACCTTGTTACGACTT，gyrB上、下游引物序列分別為TCCGGCGGTCTGCACGGCGT和TTGTCCGGGTTGTACTCGTC。引物均由廣州艾基生物技術有限公司合成。將純化的菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床過夜培養(yǎng)。取1 mL菌液12 000 r·min?1離心1 min收集菌體。使用細菌基因組DNA提取試劑盒，按照其操作指南提取基因組DNA。提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，酶標儀測定DNA濃度。接著進行PCR反應，在50 μL的16S rRNA反應體系中含有ExTaq酶 25 μL、上下游引物各 2.5 μL、ddH2O 17.5 μL、模板2.5 μL。gyrB基因PCR反應體系同上。16S rRNA基因的PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃ 復性 30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。gyrB基因的PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃復性30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應結束后，PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序，序列測定由廣州艾基生物技術有限公司完成。采用BLSAT程序 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 進行序列同源性比對。采用MEGA 7.0軟件鄰接法 (Neighborjoining, NJ) 構建進化樹，設定Bootstrap為1 000。

1.5 回歸感染實驗

離心收集培養(yǎng)24 h的菌體，經10 mmol·L?1PBS洗滌后配制成細菌懸液?；貧w感染實驗設3個實驗組與1個對照組，每組各30尾。采用高、中、低 3 種不同菌液濃度 (3×108、1.5×108、3×107CFU·mL?1) 進行腹腔注射攻毒。健康大口黑鱸魚苗每尾魚注射100 μL。對照組注射等量無菌PBS。水溫設定為30 ℃。每天觀察、記錄實驗魚死亡數量，連續(xù)觀察1周。對上述人工回歸感染出現明顯癥狀的病魚再次進行菌株分離與分子鑒定。

1.6 藥敏實驗

將分離菌株以 1.5×108CFU·mL?1的濃度涂布于BHI培養(yǎng)基平板上，貼上藥敏紙片，共17種藥物 (表1)，于28 ℃倒置培養(yǎng)24 h后測抑菌圈直徑。按產品說明書判定菌株對各藥物的敏感度。

表1 分離菌株GZXR2020對17種抗菌藥物的敏感性Table 1 Antibiotic sensitivities of isolated strain GZXR2020 to 17 antibacterials

1.7 毒力基因擴增

根據文獻[18,24]合成擴增腸毒素基因 (ast、act)、IV型菌毛基因 (tap A)、氣溶素基因 (aer) 的特異性引物。預期擴增片段長度分別為331、233、550、431 bp。ast基因上、下游引物序列分別為TCTCCATGCTTCCCTTCCACT和GTGTAGGGATTGAAGAAGCCG，tap A基因上、下游引物序列分別為ATGACCTCTAGCCCCAA TA和ACCCGATTGATTTCTGCC，aer基因上、下游引物序列分別為CCTATGGCCTGAGCGAG AAG和CCAGTTCCAGTCCCACCACT，act基因上、下游引物序列分別為GAGAAGGTGACCACCA AGAACA和AACTGACATCGGCCTTGAACTC。引物均由廣州艾基生物技術有限公司合成。使用1.4節(jié)提取的菌體基因組DNA進行PCR反應，ast、tap A、aer、act基因的反應體系為 20 μL，其中ExTaq酶10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 7 μL、模板 1 μL。ast和tap A基因的PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，53 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。aer基因的PCR反應條件為：94 ℃預變性 2 min；94 ℃ 變性 30 s，55.9 ℃ 復性 50 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。act基因的PCR反應條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃ 變性 30 s，56.4 ℃ 復性 50 s，72 ℃ 延伸 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結束后，PCR反應產物均經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 細菌分離與菌落形態(tài)

從患病大口黑鱸肝臟劃線接種于血平板，過夜培養(yǎng)后出現圓形凸起、表面光滑濕潤的灰白色菌落，菌落形狀一致。挑取血平板上的單菌落接種于BHI固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，取單一菌落進行生理生化實驗，并命名為GZXR2020。

2.2 回歸感染實驗

對健康大口黑鱸實驗魚腹腔注射菌液，每組各30尾，連續(xù)觀察7 d。感染后第1天，3×108CFU·mL?1組開始出現發(fā)病癥狀，魚體色發(fā)黑，游動不正常。3種濃度的菌液均能引起攻毒實驗魚死亡。低濃度組2尾魚死亡，死亡率為7%，中濃度組12尾魚死亡，死亡率為40%，高濃度組30尾魚死亡，死亡率為100%，對照組魚無死亡。死亡個體出現維氏氣單胞菌感染的典型癥狀 (圖1)?；貧w感染實驗證明該分離株為大口黑鱸的致病菌株。

圖1 人工感染后大口黑鱸出現的癥狀a.鱗片脫落、尾鰭基部出血；b.病魚肝臟、脾臟與腎臟腫大Figure 1 Symptoms of M.salmoides after artificial infectiona.Scale exfoliation, bleeding of the base of caudal fin; b.Swelling of liver, spleen and kidney of the infected fish

2.3 分離菌株16S rRNA和gyrB基因序列的擴增與分析

采用16S rRNA通用引物和gyrB基因特異性引物對分離菌株進行PCR擴增，分別獲得大小為1 465和1 130 bp的序列。BLAST結果顯示，所擴增的16S rRNA序列與GenBank上的維氏氣單胞菌維羅納生物型、維氏氣單胞菌溫和生物型、溫和氣單胞菌 (A.sobria)、嗜水氣單胞菌 (A.hydrophila)的同源性分別為99.9%、99.5%、98.9%、98.6%。

該菌株的gyrB序列與維氏氣單胞菌維羅納生物型、維氏氣單胞菌溫和生物型、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌的同源性分別為98.7%、98.3%、93.3%、93.4%。根據16S rRNA與gyrB基因序列采用NJ法分別構建系統進化樹，GZXR2020菌株與維氏氣單胞菌維羅納生物變種、維氏氣單胞菌溫和生物變種聚類，然后再與溫和氣單胞菌聚類，可確定分離菌為維氏氣單胞菌 (圖2)。

圖2 根據細菌16S rRNA基因序列 (a) 與gyrB基因序列 (b) 構建的系統進化樹Figure 2 Phylogenetic trees constructed based on sequences of 16S rRNA (a) and gyrB (b)

2.4 生理生化鑒定

采用梅里埃公司的VITEK2全自動細菌鑒定系統進行生理生化鑒定 (表2)。結果顯示其與氣單胞菌屬的溫和氣單胞菌的相應特征相符。

表2 分離菌株GZXR2020的生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification results of strain GZXR2020

對分離菌株進行羊血-瓊脂溶血實驗 (圖3)，結果顯示呈β-溶血。結合全自動細菌鑒定系統與溶血實驗結果，可判定該菌為維氏氣單胞菌。

圖3 分離菌株GZXR2020在羊血瓊脂板上的β-溶血環(huán)a.分離菌株GZXR2020；b.大腸桿菌；標尺顯示單菌落直徑Figure 3 Beta hemolysis of isolated strain GZXR2020 on sheep blood agara.Isolated strain GZXR2020; b.E.coli.The bar shows the single colony diameter.

2.5 菌株生物型鑒定

毒力基因擴增結果顯示，以分離菌株的DNA作模板，可擴增到act、tap A、aer基因，但ast基因缺失。維氏氣單胞菌溫和生物型具有act、tap A、aer基因，維氏氣單胞菌維羅納生物型具有act、ast、aer基因，此檢測結果與維氏氣單胞菌溫和生物型一致，可進一步判斷本分離菌株為維氏氣單胞菌溫和生物型。

精氨酸雙水解酶與七葉苷實驗結果顯示，七葉苷水解實驗為陰性，精氨酸雙水解為陽性。維氏氣單胞菌溫和生物型七葉苷水解實驗為陰性，精氨酸雙水解為陽性，維氏氣單胞菌維羅納生物型葉苷水解實驗為陽性，精氨酸雙水解為陰性，實驗結果符合維氏氣單胞菌溫和生物型。結合毒力基因檢測與補充理化鑒定結果，可判定該分離菌為維氏氣單胞菌溫和生物型。

2.6 藥敏實驗

以涂布法對分離菌株進行藥物敏感性檢測(表1)，在所檢測的17種抗菌藥物中，大觀霉素、氟羅沙星、氟苯尼考等7種藥物呈敏感反應；卡那霉素、鏈霉素2種藥物為中度敏感；妥布霉素、氨芐西林、復方新諾明等8種藥物呈耐藥性。

3 討論

維氏氣單胞菌包括維氏氣單胞菌維羅納生物型和維氏氣單胞菌溫和生物型，前者能引起人類敗血癥、上肢及皮膚軟組織感染、胃腸道腹瀉等疾病[25]，后者會導致人類腹瀉、溶血、膽道膿血等[26]。維氏氣單胞菌維羅納生物型感染可造成烏鱧肝、脾、腎壞死充血，腸道損傷[18]。維氏氣單胞菌溫和生物型感染導致尼羅羅非魚體色呈深黑色，背部出血，鱗片脫落，鰭條腐爛，患病魚內臟嚴重充血，肝、脾、腎、腦、腸道和性腺腫大[17]。維氏氣單胞菌不同生物型具有不同的理化特點，維氏氣單胞菌溫和生物型在理化檢測中七葉苷水解為陰性、精氨酸雙水解為陽性，維氏氣單胞菌維羅納生物型則相反。本研究在自然發(fā)病大口黑鱸魚苗上分離得到菌株GZXR2020，腹腔注射對健康大口黑鱸攻毒，出現肝脾腫大、腎臟出血、體表鱗片脫落及出血等癥狀。高濃度菌液 (3×108CFU·mL?1) 可導致其100%死亡，說明該菌株具有較強的致病力。

采用梅里埃公司的VITEK2全自動細菌鑒定系統對菌株進行鑒定，結果顯示為氣單胞菌屬的溫和氣單胞菌。該細菌鑒定系統可檢測4種氣單胞菌，可鑒定維氏氣單胞菌維羅納生物型，但不能鑒定維氏氣單胞菌溫和生物型。有研究顯示，溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌溫和型菌株的理化特性比較接近，因此這2種氣單胞菌鑒定時易混淆[27-29]。Brenner等[16]的研究顯示通過羊血平板溶血實驗，菌株是否具有溶血能力可區(qū)分兩者。本研究通過羊血瓊脂平板實驗，發(fā)現該菌株在羊血瓊脂平板上出現溶血現象 (圖3)，因此判定該菌株為維氏氣單胞菌。

在細菌分類鑒定中，分子鑒定具有更高的準確度。細菌16S rRNA基因因其序列的高保守性已被廣泛應用于細菌鑒定。與16S rRNA 基因相比，gyrB基因具有較高的堿基替換率，更適合親緣關系較近的菌種鑒別[30-33]。因此本研究結合16S rRNA和gyrB這2個基因對該分離菌株進行分子鑒定。16S rRNA堿基序列與維氏氣單胞菌維羅納生物型的標準株ATCC 35624的同源性為99.9%，與維氏氣單胞菌溫和生物型的菌株AER28的同源性為99.5%，但與溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌的同源性也較高，分別為98.9%和98.6%，分辨力不足。

進一步分析gyrB堿基序列，該菌株gyrB堿基序列與維氏氣單胞菌維羅納生物型的標準株ATCC 35624的同源性為98.7%，與維氏氣單胞菌溫和生物型菌株AER28的同源性為98.3%。與溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的同源性則相對較低，分別為93.3%和93.4%。因此結合16S rRNA和gyrB基因分子鑒定結果，可判斷該分離株為維氏氣單胞菌。但由于該分離株16S rRNA和gyrB這2個基因序列與維氏氣單胞菌維羅納生物型和溫和生物型的序列同源性相近，尚無法確定其屬于維氏氣單胞菌的哪種生物型。

Altwegg等[34]認為維氏氣單胞菌兩生物型的遺傳特性一致。本研究從NCBI下載8條維氏氣單胞菌溫和生物型16S rRNA序列、19條維氏氣單胞菌維羅納生物型 (包括標準株ATCC 35624) 16S rRNA基因序列，比較發(fā)現維氏氣單胞菌2種生物型的堿基序列高度保守，以NCBI上傳本序列 (Gen-Bank號MW148391) 為基準，只在其中的第949與第956堿基位點存在差異。第949位點為C或T變化，第956位點則為A或G變化，2種生物型均有此種兩堿基的差異，因此從16S rRNA基因的堿基序列上確實無法分辨兩生物型。Brenner等[16]的研究表明通過精氨酸雙水解實驗和七葉苷水解實驗可區(qū)分維氏氣單胞菌溫和生物型和維羅納生物型。本研究分離的菌株其精氨酸雙水解實驗為陽性，七葉苷水解實驗為陰性，因此可確定該菌株為維氏氣單胞菌溫和生物型。Shameena等[24]通過ast、tap A毒力基因的攜帶與否成功區(qū)分維氏氣單胞菌溫和生物型和維羅納生物型。本研究檢測4種毒力基因 [ 腸毒素基因 (ast、act)、IV型菌毛基因(tap A)、氣溶素 (aer)]，發(fā)現菌株ast毒力基因缺失，但能檢測到tap A毒力基因，因此可進一步確定菌株為維氏氣單胞菌溫和生物型。綜合生理生化、分子鑒定與毒力基因檢測結果，可判定本研究分離的菌株為維氏氣單胞菌溫和生物型。

維氏氣單胞菌的最適生長溫度為28～37 ℃[5]。近年來已有多例維氏氣單胞菌感染導致大口黑鱸苗種或成魚死亡的報道[19-22]，暴發(fā)時間多在7月。查詢相關的氣象資料發(fā)現，當時在江蘇、四川與湖北大口黑鱸發(fā)病季節(jié)的溫度介于24～34 ℃，而本研究病害暴發(fā)時間是5月。廣東地區(qū)為亞熱帶季風氣候，氣溫與水溫較內陸提升較快，5月佛山的水溫已達25～32 ℃。4—5月是廣東大口黑鱸魚苗標粗期，也是各主養(yǎng)區(qū)對規(guī)格苗種需求量最大的時期，維氏氣單胞菌的感染導致大口黑鱸魚苗的大量死亡，嚴重影響了池塘放養(yǎng)計劃，甚至造成無苗可養(yǎng)的局面。魚苗培育過程中大規(guī)模死亡有逐年加劇的趨勢。溫度的升高以及育苗系統中水質的維持壓力增大，導致維氏氣單胞菌感染增殖，從而引發(fā)苗種批量死亡。由于近年來大口黑鱸病毒攜帶情況有所加重[35]，因此不排除病毒與細菌混合感染加劇魚苗死亡的可能性。維持良好的水環(huán)境、提高魚體的免疫力是大口黑鱸育苗與養(yǎng)殖成功的關鍵。

本研究的藥敏實驗共分析了17種藥物，其中敏感性藥物7種，包括大觀霉素、利福平和四環(huán)素等，占比為41%；耐藥藥物8種，包括阿莫西林、青霉素和氨芐西林等，占比為47%。本研究中卡那霉素與鏈霉素屬于中等敏感藥物，利福平和四環(huán)素屬于敏感藥物，但以往研究表明大口黑鱸對這4種藥物均顯示出耐藥性[19,21-22]。這種由耐藥性到敏感性的變化，說明我國制定的一系列控制漁業(yè)藥物限制使用的法律法規(guī)已初見成效，水產養(yǎng)殖人員藥物使用意識有所提高。由于在大口黑鱸育苗和養(yǎng)殖過程中存在病害加劇的趨勢，極易出現濫用藥引發(fā)的產品質量安全問題。因此，大口黑鱸養(yǎng)殖應注重科學管理與生態(tài)調控，減少藥物用量，安全用藥，不使用禁用藥物，以保證養(yǎng)殖的順利進行與產品的質量安全。

4 結論

本研究從自然患病大口黑鱸的肝臟中分離出菌株GZXR2020，回歸感染實驗出現與自然發(fā)病魚類似的癥狀，經生理生化、毒力基因檢測、分子鑒定等方法，證實引起廣東佛山某養(yǎng)殖場大口黑鱸魚苗暴發(fā)性死亡的病原菌為維氏氣單胞菌溫和生物型，為制定大口黑鱸安全有效的病害防控措施及下一步疫苗的研制提供了一定的理論依據。