華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠生殖能力的影響

鄭環(huán)宇，高加龍,2，章超樺,2，司 蕊，鄭惠娜,2，曹文紅,2，秦小明,2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院/國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心 (湛江) /廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋生物制品工程實驗室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué)/海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

華貴櫛孔扇貝 (Chlamys nobilis) 隸屬瓣鰓綱、珍珠貝亞目、扇貝科[1]，為暖水性貝類，是我國南方海域的主要養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一。其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，富含精氨酸、?；撬?、硒元素、VE等營養(yǎng)物質(zhì)[2]；該貝類生長快且不易儲存，除鮮銷及加工成干制品外，深加工利用價值低。目前，對華貴櫛孔扇貝的研究主要集中在遺傳育種[3]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[4]等方面，利用其進行生物活性方面的研究鮮有報道。

性欲障礙、勃起功能障礙和射精障礙等癥狀是男性常見的多發(fā)性疾病，其中勃起功能障礙 (Eretile dysfunction, ED) 指男子在性刺激下，持續(xù)無法維持足夠硬度的陰莖勃起以獲得滿意的性表現(xiàn)[5]。目前，ED已成為困擾全球男性的重要疾病之一，1995年全世界男性ED患者約1.52億人，預(yù)計到2025年將增至3.22億人[6]。原發(fā)性性腺機能減退及疾病、創(chuàng)傷等原因造成的睪丸損傷均可導(dǎo)致雄性性激素水平下降、引發(fā)ED等性功能障礙問題[7]。目前，營養(yǎng)藥品和膳食補充劑成為治療性功能障礙的一種可行選擇[8]，隨著對性健康認識的提高，男性群體對改善性功能障礙膳食補充劑的需求也逐漸增加。研究表明，海洋生物資源如海馬[9]、海參[10]、貽貝[11]、牡蠣[12-13]等均對男性生殖能力具有良好的保護作用，是制備此類膳食補充劑的良好來源。據(jù)《動物本草》記載，扇貝可滋陰補腎、調(diào)中，主治陰虛勞損、腎虛腰痛、遺精等癥[14]。為探究富含精氨酸、硒 (Se) 元素等營養(yǎng)物質(zhì)的華貴櫛孔扇貝是否有改善男性生殖能力障礙的功效，本研究對SD雄性大鼠進行半去勢手術(shù)，建立雄性大鼠生殖能力減退模型，考察華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠生殖能力及血清性激素水平等的影響，以期為挖掘扇貝的生理功效及開發(fā)扇貝作為改善男性生殖能力障礙的膳食補充劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物

華貴櫛孔扇貝于2019年7月采自廣東省雷州市覃斗鎮(zhèn)養(yǎng)殖場，開殼取肉并去除內(nèi)臟團、足絲得扇貝可食部分，于?40 ℃凍藏備用。

SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量約 (300±20) g；SPF級SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量 (280±20) g [ 使用許可證號 SCXK (魯) 20190003]。于相對濕度50%～60%、溫度 (24±2) ℃下自由進食飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

動物蛋白酶，酶活力 13×104U·g?1(廣西南寧龐博生物有限公司)；枸櫞酸西地那非 (國藥準(zhǔn)字H20020526，輝瑞制藥有限公司)；水合氯醛 (上海源葉生物科技有限公司)；大鼠睪酮 (T)、大鼠促黃體激素 (LH)、大鼠促卵泡生長激素 (FSH) ELISA試劑盒 (江蘇酶免實業(yè)有限公司)；一氧化氮 (NO)測定試劑盒、總一氧化氮合成酶 (NOS) 測試盒、考馬斯亮藍總蛋白測定試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。注射用頭孢噻呋鈉 (抗生素，艾美科健生物醫(yī)藥有限公司)；苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液 (寧波第二激素廠)；其余試劑均為分析純。

FA1004分析天平 (上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；VAPODEST-450全自動凱氏定氮儀 (德國格哈特分析儀器有限公司)；L-8900全自動氨基酸分析儀 (株式會社日立制作所)；G50組織研磨儀(卡尤迪生物科技有限公司)；Thermo Varioskan Flash多功能全自動酶標(biāo)儀；Lynx6000高速落地離心機 (美國Thermo公司)；N-4000大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；FDU-1100型真空冷凍干燥機 (東京理化器械株式會社)；ZS-YLS-9A生理、藥理電子刺激儀 (上海眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)；UV-5100紫外分光光度計 (上海元析儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 貝肉及其酶解產(chǎn)物的制備 根據(jù)前期優(yōu)化的酶解工藝條件制備華貴櫛孔扇貝肉酶解產(chǎn)物。取凍藏華貴櫛孔扇貝肉可食用部位，于 (?18±1) ℃暫貯24 h后轉(zhuǎn)至 (4±1) ℃解凍，洗凈瀝干勻漿。勻漿液經(jīng)冷凍干燥得華貴櫛孔扇貝肉試樣 (CN)；另取勻漿液加蒸餾水至料液質(zhì)量體積比為1∶3，調(diào)節(jié)pH至7.0，按3 000 U·g?1加入動物蛋白酶，于50 ℃ 恒溫水浴中酶解4 h，沸水浴滅酶15 min，迅速冷卻后經(jīng)8 000 r·min?1離心20 min，過濾收集上清液，旋蒸濃縮后經(jīng)冷凍干燥得華貴櫛孔扇貝肉酶解產(chǎn)物試樣 (CNH)；測得CNH的水解度為29.87%。

1.3.2 基本成分測定 水分：常壓干燥法 (GB 5009.3—2016)；粗蛋白：凱氏定氮法 (GB 5009.5—2016)；粗脂肪：索氏提取法 (GB 5009.6—2016)；灰分：高溫灼燒法 (GB 5009.4—2016)；總糖：苯酚-硫酸法 (GB/T 9695.31—2008)。

1.3.3 氨基酸組成測定 貝肉酶解產(chǎn)物氨基酸按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124—2016進行測定。

1.3.4 微量元素測定 貝肉酶解產(chǎn)物的鐵 (Fe)、鋅 (Zn)、Se、銅 (Cu)、錳 (Mn) 按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.268—2016的微波消解-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法進行測定。

1.3.5 實驗動物去勢模型構(gòu)造 對32只SD雄性大鼠進行半去勢手術(shù)，經(jīng)15%水合氯醛麻醉消毒后，于大鼠陰囊部右側(cè)作1 cm左右切口，分離右側(cè)睪丸及附睪，在附睪頭尾之間結(jié)扎，摘除右側(cè)睪丸；另取8只SD雄性大鼠在陰囊部位作1 cm左右切口，不摘除睪丸，行假手術(shù)[15]。各組大鼠手術(shù)后使用注射用頭孢噻呋鈉 (抗生素) 15 mg·kg?1，注射3 d，同時對傷口進行碘酊消毒，防止感染。

對SD雌性大鼠進行全去勢手術(shù)，經(jīng)15 mg·kg?1鹽酸賽拉嗪麻醉后，剪除兩側(cè)背部手術(shù)區(qū)毛發(fā)并消毒，以大鼠最后一肋與大腿根部連線的中點皮膚處行1 cm切口，肌肉層行0.5 cm的切口，擠壓腎臟后下側(cè)包裹卵巢的脂肪團，結(jié)扎后摘除卵巢[16]。兩側(cè)同法。手術(shù)后使用注射用頭孢噻呋鈉 (抗生素)30 mg·kg?1，注射3 d，同時對傷口進行碘酊消毒，防止感染。

1.3.6 實驗動物分組 將恢復(fù)性飼養(yǎng)2周的半去勢SD雄性大鼠32只隨機分為4組，每組8只，分別為陽性對照組 (PC)、陰性對照組 (SM)、華貴櫛孔扇貝肉酶解產(chǎn)物組 (CNH)、華貴櫛孔扇貝肉組(CN)；另行假手術(shù)的8只SD雄性大鼠作為空白對照組 (NC)。NC、SM 組灌胃生理鹽水 1.5 mL·(kg·d)?1；PC 組灌胃枸櫞酸西地那非 1.5 mg·(kg·d)?1；CNH、CN 組分別灌胃試樣 1.3 g·(kg·d)?1。灌胃 7 周，期間大鼠自由進食飲水。

1.3.7 實驗動物性行為表現(xiàn) 行為學(xué)實驗于灌胃48 d后進行。實驗前48 h對雌性去勢大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液200 μg·kg?1，雌雄合籠前4 h皮下注射黃體酮注射液2 mg·kg?1，以獲得發(fā)情良好的雌鼠[17]。實驗于20:00—24:00進行，實驗前將雄鼠放置觀察箱 (30 cm × 40 cm × 40 cm) 中適應(yīng)10 min，用高清攝像頭記錄。從放進雌鼠起開始記錄，觀察前30 min，并記錄大鼠的撲捉次數(shù)、騎乘次數(shù)、撲捉潛伏期、騎乘潛伏期[18-19]、勃起潛伏期。撲捉次數(shù)為雄鼠嗅聞雌鼠尾根部后進行撲捉雌鼠行為的次數(shù)；撲捉潛伏期為放入雌鼠后，至發(fā)生第一次撲捉行為的時間；騎乘次數(shù)為雄鼠撲捉雌鼠后進行交配行為的次數(shù) (有無射精都計，即雄性大鼠發(fā)生騎乘行為后舔舐陰莖的表現(xiàn))；騎乘潛伏期為放入雌鼠后，至發(fā)生第一次騎乘行為的時間；勃起潛伏期為生理、藥理電子刺激儀正負極置于雄性大鼠陰莖根部，儀器參數(shù)為電流強度為4 mA，波寬為100 mS，電壓為0.2 V，記錄大鼠從電極接觸陰莖開始至陰莖勃起的時間[20]。

1.3.8 附性腺臟器系數(shù)的測定 末次給藥后稱質(zhì)量麻醉，眼球取血后迅速分離出大鼠左側(cè)睪丸、陰莖、附睪、精囊腺-前列腺組織，并使用電子天平稱質(zhì)量 (g)，計算臟器系數(shù)[21]。

1.3.9 血清性激素水平測定 眼球取血后室溫自然凝固 15 min，經(jīng) 3 000 r·min?1離心 15 min，收集上層血清，用于測定血清中的T、FSH和LH。

1.3.10 陰莖組織NO和NOS的測定 分離大鼠陰莖組織，剪除陰莖的表面皮膚、陰莖頭，于冰浴中剪碎勻漿、離心，取上清液，使用考馬斯亮藍法測定組織蛋白質(zhì)含量；硝酸還原法測定NO濃度，比色法測定NOS活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用JMP 10和Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與繪圖。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示。對數(shù)據(jù)進行組間差異性顯著分析，執(zhí)行最小二乘均值studentt檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物的基本組成

CN及CNH的基本營養(yǎng)成分見表1，以干質(zhì)量計，CN與CNH蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高 (分別為75.48%與76.14%)；經(jīng)酶解后CNH的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低 (僅0.77%)。由此可見，華貴櫛孔扇貝是一種高蛋白低脂肪的海洋食物。

表1 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物的基本成分Table 1 Content of basic component in C.nobilis and its enzymatic hydrolysates %

2.2 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物的氨基酸組成

Tan等[22]報道華貴櫛孔扇貝含有大量易于消化且符合人類膳食需求的必需氨基酸，可改善生物體的生長、發(fā)育、繁殖等生理機能。本研究測到華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物含16種氨基酸 (表2)，兩者的必需氨基酸有7種，水解必需氨基酸與總氨基酸的比值 (EAA/TAA) 分別為32.85%、34.35%，游離EAA/TAA分別為5.24%、41.73%，所含氨基酸構(gòu)成較均衡。CNH的水解支鏈氨基酸 (纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸) 含量較高，占氨基酸總量的16.21%，補充適量的支鏈氨基酸對精子功能和睪丸激素的產(chǎn)生有促進作用[23]；CN、CNH水解氨基酸中精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為13.07、20.90 g·kg?1，游離氨基酸中的精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為56.04、55.16 g·kg?1，其中L-精氨酸能在NOS的催化下合成NO，產(chǎn)生瓜氨酸[24]，是促進生殖激素發(fā)生的潛在物質(zhì)。

表2 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物的氨基酸組成 (干質(zhì)量)Table 2 Amino acid composition of C.nobilis and its enzymatic hydrolysates (dry mass) g·kg?1

2.3 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物的微量元素含量

華貴櫛孔扇貝肉的微量元素Zn、Fe、Mn、Cu、Se質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為114.51、691.76、20.46、5.19、2.87 mg·kg?1；華貴櫛孔扇貝肉酶解產(chǎn)物的Zn、Fe、Mn、Cu、Se質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為84.13、32.59、8.20、1.28、1.22 mg·kg?1。Se 是人體精子發(fā)生必需的微量元素，由Se參與組成的谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPx4)，是人體內(nèi)唯一可直接降解磷脂氫肽過氧化物 (PHGPx) 的酶，對調(diào)控睪丸組織中的精子發(fā)生與成熟起重要作用[25-26]。另外，Zn是維持睪丸生精細胞、促進精子發(fā)生并調(diào)節(jié)精子活力的必需微量元素[27]。

2.4 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠性行為表現(xiàn)的影響

撲捉、騎乘等指標(biāo)可反映雄性大鼠性行為的能力[28]。各組大鼠性行為情況見表3，對SD雄性大鼠行半去勢手術(shù)后，陰性對照組撲捉行為、騎乘行為顯著減少 (P＜0.05)、潛伏期顯著延長 (P＜0.05)。與對照組相比，CN、CNH兩組大鼠撲捉次數(shù)和騎乘次數(shù)均有不同程度的增加，撲捉潛伏期和騎乘潛伏期均有不同程度的縮短。其中，CN組大鼠的撲捉次數(shù)和騎乘次數(shù)相較于陰性對照組顯著增加(P＜0.01)；CNH組大鼠的撲捉潛伏期與騎乘潛伏期相較于陰性對照組顯著縮短 (P＜0.05)，且改善效果優(yōu)于陽性對照組。性行為表現(xiàn)結(jié)果說明CN和CNH組均有提高大鼠性欲、改善半去勢雄性大鼠性行為的功效，且CNH組的改善作用更佳。

表3 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠性行為表現(xiàn)的影響Table 3 Effects of C.nobilis and its enzymatic hydrolysates on sexual behavior in hemi-castrated male rats

2.5 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠勃起潛伏期的影響

使用微弱電流刺激陰莖勃起，可直觀地判斷樣品是否能改善大鼠勃起功能障礙。各組大鼠勃起潛伏期見圖1，對雄性大鼠行半去勢手術(shù)后陰莖勃起潛伏期顯著延長 (P＜0.01)，陽性對照組能明顯改善大鼠的陰莖勃起潛伏期 (P＜0.01)。與陰性對照組相比，CN和CNH組均顯著縮短了半去勢雄性大鼠的陰莖勃起潛伏期 (P＜0.01)，但高于空白對照組。其中，CNH組的改善效果好于CN組，與陽性對照組的效果相當(dāng)。

圖1 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠勃起潛伏期的影響Figure 1 Effects of C.nobilis and its enzymatic hydrolysates on erection latency in hemi-castrated male rats

2.6 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠臟器系數(shù)的影響

CN和CNH對半去勢雄性大鼠臟器系數(shù)的影響見表4，不同組大鼠的左側(cè)睪丸、精囊腺-前列腺等性腺器官系數(shù)顯示出不同的變化。與陰性對照組相比，CN和CNH組大鼠精囊腺-前列腺的質(zhì)量及臟器系數(shù)顯著增大 (P＜0.01)。前列腺和精囊腺的質(zhì)量變化可以作為一個良好的、相對快速反映雄激素水平變化的指標(biāo)[29]。各組雄性大鼠的附睪系數(shù)均無顯著性變化。CN和CNH組的左側(cè)睪丸系數(shù)，相比陰性對照組與空白對照組，差異均達到顯著水平 (P＜0.05)。結(jié)合激素水平結(jié)果，左側(cè)睪丸系數(shù)的增大可能與睪丸代償[30]有關(guān)。雄激素具有刺激附性腺器官細胞增殖、增大的作用，因而能使雄性動物的附性腺器官系數(shù)增加的樣品具有雄激素樣作用，并可通過系數(shù)的變化程度判斷雄激素樣作用強度[31]。

表4 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠臟器系數(shù)的影響Table 4 Effects of C.nobilis and its enzymatic hydrolysates on organ coefficient in hemi-castrated male rats

2.7 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠血清激素水平的影響

CN和CNH對半去勢雄性大鼠血清T的影響結(jié)果見圖2-a。對SD雄性大鼠行半去勢手術(shù)后，陰性對照組大鼠的T濃度顯著降低 (P＜0.01)，灌胃CN和CNH后，半去勢雄性大鼠血清T的濃度較陰性對照組顯著上升 (P＜0.01)，但低于空白對照組 (P＜0.05) 與陽性對照組。對于FSH，各組均顯著高于空白對照組 (P＜0.01，圖2-b)，CN、CNH組FSH低于陰性對照組，但無顯著性差異。

圖2 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠血清睪酮、促卵泡激素和黃體生成素的影響Figure 2 Effects of C.nobilis and its enzymatic hydrolysates on serum testosterone, follicle stimulating hormone and luteinizing hormone in hemi-castrated male rats

LH的變化結(jié)果見圖2-c，CN、CHN組LH濃度顯著高于空白對照組 (P＜0.05)，顯著低于陰性對照組 (P＜0.05)；CHN組略高于CN組，與陽性對照組水平相當(dāng)。LH和FSH分別作用于睪丸間質(zhì)細胞和睪丸支持細胞，調(diào)節(jié)性腺發(fā)育及生精過程，兩者通過反饋調(diào)節(jié)介導(dǎo)睪丸組織分泌雄性激素T，進而刺激雄性器官的發(fā)育并維持其生理功能[32]。對大鼠行半去勢手術(shù)后，T分泌量的減少介導(dǎo)“下丘腦-垂體-睪丸軸”的正反饋調(diào)節(jié)，促使下丘腦分泌更多的黃體生成素釋放激素，進一步刺激垂體釋放LH；同時半去勢引起類固醇激素或來自支持細胞的非類素 (抑制素B) 的下降，通過正反饋作用，促使垂體前葉分泌更多的FSH[15]。本實驗結(jié)果表明CN和CNH均能介導(dǎo)“下丘腦-垂體-睪丸軸”，調(diào)節(jié)半去勢雄性大鼠的血清性激素至正常大鼠水平。

2.8 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠陰莖組織NO、NOS的影響

各組大鼠陰莖組織的NO、NOS變化見圖3。對雄性大鼠行半去勢手術(shù)后，陰性對照組大鼠陰莖組織的NO濃度和NOS活性顯著降低 (P＜0.01)，與陰性對照組相比，陽性對照組、CNH組NO濃度均顯著提高 (P＜0.01)，且優(yōu)于CN組 (P＜0.05)。CN和CNH組均能顯著提高大鼠陰莖組織中的NOS活性 (P＜0.05)，與陽性對照組的效果相當(dāng)。有研究表明，T可介導(dǎo)和維持雄性動物生殖器官內(nèi)NOS活性，并在勃起期間刺激神經(jīng)型一氧化氮合酶 (nNOS) 基因表達并誘導(dǎo)陰莖海綿體和陰莖動脈生成NO[33]。大鼠去勢后，陰莖組織中的NOS活性明顯降低，影響L-arg-NO-cGMP通路[34]，導(dǎo)致NO生成量減少。NO通過陰莖海綿體內(nèi)皮細胞釋放，形成cGMP，引起陰莖海綿體平滑肌松弛。對大鼠行半去勢后，T水平明顯下降，引起血清-1-磷酸鞘氨醇 (S1P) 的變化，S1P1受體減少，S1P2、S1P3受體增加，導(dǎo)致RhoA/Rho激酶途徑上調(diào)，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 活性以降低NO的產(chǎn)生[35]。NOS活力和NO水平明顯降低，引起大鼠勃起功能障礙。本研究表明，CN和CNH可通過增加大鼠陰莖NO的釋放、提高NOS活力來增強陰莖勃起能力，從而達到改善生殖能力的目的。

圖3 華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠陰莖一氧化氮和總一氧化氮合酶活性的影響Figure 3 Effects of C.nobilis and its enzymatic hydrolysates on NO and NOS in penile tissue of hemi-castrated male rats

3 結(jié)論

本文通過動物實驗研究了華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物對半去勢雄性大鼠生殖能力的改善作用。結(jié)果表明，華貴櫛孔扇貝肉及其酶解產(chǎn)物均具有顯著縮短半去勢雄性大鼠勃起潛伏期、增加騎乘次數(shù)等性行為表現(xiàn)的作用，同時能夠增大附性腺器官的臟器系數(shù)，具有穩(wěn)定大鼠血清性激素水平、介導(dǎo)NO和NOS生成等功效。酶解產(chǎn)物的效果優(yōu)于貝肉，但對于改善雄性大鼠生殖能力活性成分的解析還有待進一步研究。