硫酸銅治療卵形鯧鲹淀粉卵渦鞭蟲病的研究

李志成，江 飚，鐘志鴻，李詩鈺，何潤真，唐嘉嘉，李安興

（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省水生經(jīng)濟動物良種繁育重點實驗室，廣東 廣州 510275；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225）

眼點淀粉卵渦鞭蟲 (Amyloodinium ocellatum) 隸屬于肉鞭動物門、植鞭綱、腰鞭目、胚乳科、淀粉卵渦鞭蟲屬，是一種寄生鞭毛蟲，通常寄生于熱帶、亞熱帶海水魚類的鰓、皮膚和鰭條等處[1-2]。其生活史包括渦孢子、營養(yǎng)體、包囊3個階段，環(huán)境適宜時可在1周內(nèi)完成1個生活史周期[3-6]。大量眼點淀粉卵渦鞭蟲寄生于魚體可引起嚴重的淀粉卵渦鞭蟲病，該病具有爆發(fā)速度快、危害大等特點，可導(dǎo)致海水養(yǎng)殖魚類大量死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失[7-10]。

卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 是我國南方重要的海水魚養(yǎng)殖品種，具有生長速度快、飼料轉(zhuǎn)化率高、肉質(zhì)鮮美等特點[11-13]。然而，隨著高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境逐漸惡化，卵形鯧鲹病害頻發(fā)，其中寄生蟲病極為顯著，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失[14-17]。常見感染卵形鯧鲹的寄生蟲有刺激隱核蟲 (Cryptocaryon irritans)、車輪蟲(Trichodina) 和眼點淀粉卵渦鞭蟲等[18]。卵形鯧鲹淀粉卵渦鞭蟲病主要爆發(fā)于室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖或池塘養(yǎng)殖等養(yǎng)殖密度高、水體交換量小的養(yǎng)殖環(huán)境。

硫酸銅是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用藥物，可用于殺滅原生動物病原如車輪蟲、眼點淀粉卵渦鞭蟲等[19-20]，其作用機理是銅離子與蟲體的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，達到殺滅蟲體、防治魚病的目的[21]。Virgula等[22]使用質(zhì)量濃度為2、1 mg·L?1的硫酸銅溶液浸泡魚體1、24 h均可有效治療遮目魚 (Chanos chanos) 淀粉卵渦鞭蟲病，說明利用硫酸銅防治海水魚類淀粉卵渦鞭蟲病具有顯著效果。然而，硫酸銅對水產(chǎn)動物具有較強的毒性，濃度過高會導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類中毒死亡，濃度太低對眼點淀粉卵渦鞭蟲不具有毒殺作用[23]。目前，使用硫酸銅防治卵形鯧鲹淀粉卵渦鞭蟲病的資料匱乏，特別是最低有效劑量和合理應(yīng)用方法尚無資料。因此，研究科學(xué)合理地使用硫酸銅，減少其在殺蟲過程中對魚體及周圍環(huán)境產(chǎn)生副作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 眼點淀粉卵渦鞭蟲收集和傳代

從養(yǎng)殖過程中自然爆發(fā)淀粉卵渦鞭蟲病的卵形鯧鲹鰓處分離并收集包囊，按照Bower和Biever[24]的方法以(3.35±0.25) g卵形鯧鲹幼魚作為宿主，使用每尾魚4 000～6 000渦孢子的亞致死劑量感染卵形鯧鲹。并于2 d后將感染魚浸泡于淡水中，使?fàn)I養(yǎng)體從魚體脫落。將收集的包囊用滅菌海水沖洗數(shù)次后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化并收集渦孢子進行下一輪感染，建立本實驗蟲株的傳代系統(tǒng)，以便隨時獲取足夠數(shù)量的包囊和渦孢子用于實驗。

1.2 卵形鯧鲹的養(yǎng)殖管理

實驗所用的卵形鯧鲹 (3.35±0.25) g購于廣東省深圳市大鵬新區(qū)某魚排。實驗魚在容積為500 L的圓形塑料桶中暫養(yǎng)2周，每日早晚投喂商品飼料，日投喂量為魚體質(zhì)量的2%～3%。養(yǎng)殖用水為自然海水，鹽度31～33，水溫27.4～29.2 ℃，pH 8.0～8.5，溶解氧質(zhì)量濃度＞6 mg·L?1，氨氮質(zhì)量濃度 0.6～0.7 mg·L?1，流水養(yǎng)殖，每日吸污。

1.3 硫酸銅溶液對渦孢子的體外殺蟲實驗

根據(jù)Bower和Biever[24]的渦孢子計數(shù)方法，收集在9 h內(nèi)孵化出的渦孢子，置于50 mL離心管中混勻，用移液槍吸取10份，每份2 μL蟲液于細胞計數(shù)板計數(shù)，并計算渦孢子的密度，用滅菌海水稀釋蟲液用于后續(xù)實驗。

配制質(zhì)量濃度為200 mg·L?1的硫酸銅 (CuSO4) 原液。在96孔板中加入硫酸銅原液并進行梯度稀釋，每孔加入100 μL (約200渦孢子) 蟲液。最高濃度組的硫酸銅溶液質(zhì)量濃度為 100 mg·L?1，最低濃度組為 0.012 5 mg·L?1。以滅菌海水作為對照組，每個濃度設(shè)置3個平行，室溫下孵育，于第10、第30、第60和第120分鐘觀察渦孢子活力，渦孢子停止游動并沉于底部則判定為死亡，能引起渦孢子100%死亡的濃度即為有效質(zhì)量濃度。

1.4 硫酸銅溶液對包囊的體外殺蟲實驗

收集從魚體脫落的包囊，用滅菌海水反復(fù)沖洗數(shù)次以去除雜質(zhì)，在96孔板中每孔加入20～30顆包囊。將質(zhì)量濃度為200 mg·L?1的硫酸銅溶液進行梯度稀釋，使最高濃度組的硫酸銅溶液為 100 mg·L?1，最低濃度組為 0.1 mg·L?1。以滅菌海水作為對照組，每個濃度設(shè)置3個平行，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。包囊在不同質(zhì)量濃度的硫酸銅溶液中連續(xù)孵育并于第24、第48、第72和第96小時分別觀察并統(tǒng)計包囊的分裂情況，計算包囊分裂率。

1.5 硫酸銅溶液對卵形鯧鲹幼魚的急性毒性實驗

為確定實驗硫酸銅溶液有效質(zhì)量濃度范圍，在正式實驗前先進行預(yù)實驗，獲得硫酸銅溶液對卵形鯧鲹96 h無死亡的最高質(zhì)量濃度為100 mg·L?1；24 h內(nèi)卵形鯧鲹100%死亡的最低質(zhì)量濃度為300 mg·L?1。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以1.3間隔系數(shù)設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度組，分別為300.00、230.77、177.51、136.55、105.04 mg·L?1，以自然海水為對照組，每組10尾魚，設(shè)置2個平行。分別記錄第24、第48、第72和第96小時每組魚的死亡情況并及時清理死魚，實驗期間不投喂飼料。實驗魚死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為：喪失游動能力，停止呼吸，沉于池底，觸碰無反應(yīng)。各時間點的半致死質(zhì)量濃度 (LC50) 和安全質(zhì)量濃度按照江飚等[25]的方法進行計算。

1.6 硫酸銅溶液對魚體上營養(yǎng)體的驅(qū)除實驗

分別配制質(zhì)量濃度為4.0、2.0、1.0、0.5、0.4、0.3、0.2 mg·L?1的硫酸銅溶液100 L，以自然海水作為對照組。以每尾魚8 000渦孢子的劑量人工感染卵形鯧鲹，感染36 h后將病魚同時放入不同質(zhì)量濃度的硫酸銅溶液中，每組40尾魚。經(jīng)硫酸銅溶液浸泡處理0、0.5、1、2、4、8 h后分別從每個實驗組中隨機撈取5尾魚，取左側(cè)第二片鰓在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計營養(yǎng)體數(shù)量。計算不同質(zhì)量濃度硫酸銅浸泡不同時間對卵形鯧鲹的相對驅(qū)蟲率。計算公式為：

式中D為相對驅(qū)蟲率，N為卵形鯧鲹在硫酸銅溶液中浸泡前鰓絲上營養(yǎng)體數(shù)量，Nt為卵形鯧鲹在硫酸銅溶液中浸泡不同時間后鰓絲上營養(yǎng)體數(shù)量。

1.7 低濃度硫酸銅溶液連續(xù)藥浴治療實驗

根據(jù)體外實驗結(jié)果，分別用質(zhì)量濃度為0.2、0.4 mg·L?1硫酸銅溶液連續(xù)藥浴治療卵形鯧鲹淀粉卵渦鞭蟲病，以自然海水為對照組，每組10尾魚。實驗前以眼點淀粉卵渦鞭蟲人工感染卵形鯧鲹，感染后24 h將病魚分別放入100 L質(zhì)量濃度為0.2、0.4 mg·L?1的硫酸銅溶液和100 L自然海水中靜水養(yǎng)殖。每日記錄各組魚的死亡數(shù)，觀察是否有發(fā)病癥狀，并及時撈出死魚，共記錄10 d，并在第10天從每組存活的魚中隨機撈取3尾，取鰓鏡檢，觀察是否仍有眼點淀粉卵渦鞭蟲寄生。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0和Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行差異顯著性分析，并使用Graph-Pad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 硫酸銅溶液對渦孢子殺滅作用

將渦孢子置于不同質(zhì)量濃度的硫酸銅溶液中，統(tǒng)計不同時間點各質(zhì)量濃度硫酸銅溶液中渦孢子存活情況。實驗結(jié)果顯示，硫酸銅對渦孢子具有很強的殺滅作用，在10、30、60、120 min藥浴時間內(nèi)殺死100%渦孢子的最低硫酸銅質(zhì)量濃度分別為 3.13、0.78、0.20、0.20 mg·L?1(表1)。

表1 硫酸銅溶液對眼點淀粉卵渦鞭蟲渦孢子的殺滅效果Table 1 Effect of copper sulfate solution on A.ocellatum dinospores

2.2 硫酸銅溶液對包囊的殺滅作用

將包囊置于不同質(zhì)量濃度的硫酸銅溶液中連續(xù)藥浴，分別在藥浴24、48、72、96 h后進行觀察。結(jié)果顯示，包囊的發(fā)育過程受硫酸銅溶液影響不顯著 (表2)，100.00 mg·L?1硫酸銅溶液組和對照組在連續(xù)浸泡24 h后均能正常分裂，兩組包囊的最終分裂率分別為 (90.92±1.90) %和 (96.94±2.68) %。具有發(fā)育能力的包囊在24 h內(nèi)已完成發(fā)育，各處理組包囊在第48、第72、第96小時的分裂率均與第24小時的分裂率相同。

表2 硫酸銅溶液對眼點淀粉卵渦鞭蟲包囊分裂率的影響Table 2 Effect of copper sulfate solution on A.ocellatum tomonts cleavage rate %

2.3 硫酸銅溶液對卵形鯧鲹幼魚的安全劑量

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，以1.3間隔系數(shù)設(shè)置5個實驗組，硫酸銅溶液質(zhì)量濃度分別為300.00、230.77、177.51、136.55和105.04 mg·L?1。結(jié)果顯示，當(dāng)硫酸銅溶液質(zhì)量濃度為300.00 mg·L?1時，實驗魚12 h內(nèi)出現(xiàn)體色發(fā)黑、頭朝上斜游、體表黏液增多等中毒癥狀，在24 h內(nèi)全部死亡，表明該濃度硫酸銅是卵形鯧鲹的中毒劑量，其余濃度均出現(xiàn)不同程度的死亡，而對照組在96 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡 (表3)。計算可知，硫酸銅對卵形鯧鲹幼魚第24、第48、第72和第96小時的LC50分別為202.57、180.59、173.78和173.78 mg·L?1；安全質(zhì)量濃度小于 43.06 mg·L?1。

表3 卵形鯧鲹幼魚對硫酸銅溶液的耐受力Table 3 Tolerance of juvenile T.ovatus to copper sulfate solution

2.4 硫酸銅溶液對魚體營養(yǎng)體的驅(qū)除效果

將人工感染眼點淀粉卵渦鞭蟲的卵形鯧鲹幼魚浸泡于不同質(zhì)量濃度的硫酸銅溶液中，在不同時間點從每個實驗組中隨機撈取5尾，統(tǒng)計左側(cè)第二片鰓上營養(yǎng)體數(shù)量。結(jié)果顯示，眼點淀粉卵渦鞭蟲營養(yǎng)體對硫酸銅敏感 (表4)，最低有效驅(qū)蟲質(zhì)量濃度為 0.4 mg·L?1，在 0.4 mg·L?1硫酸銅溶液中藥浴8 h可使99%以上的營養(yǎng)體從魚體脫落；在1.0 mg·L?1硫酸銅中藥浴 4 h (圖1)，2.0 mg·L?1硫酸銅中藥浴2 h均可100%驅(qū)除魚體上的營養(yǎng)體。

表4 不同質(zhì)量濃度硫酸銅浸泡不同時間的相對驅(qū)蟲率Table 4 Relative deworming rate of different mass concentrations of copper sulfate immerse for different time

圖1 寄生在病魚鰓處的眼點淀粉卵渦鞭蟲營養(yǎng)體顯微鏡觀察a.感染魚鰓上營養(yǎng)體寄生情況；b.感染魚經(jīng)1 mg·L?1硫酸銅溶液浸泡1 h后鰓上營養(yǎng)體寄生情況；c.感染魚經(jīng)1 mg·L?1硫酸銅溶液浸泡4 h后鰓上營養(yǎng)體寄生情況Figure 1 Microscopic observation of trophonts on gill of infection fisha.Parasitism of trophonts on the gill of infected fish; b.Parasitism of trophonts on the gills of infected fish after being immersed in 1 mg·L?1 copper sulfate solution for 1 h; c.Parasitism of trophonts on the gills of infected fish after being immersed in 1 mg·L?1 copper sulfate solution for 4 h

2.5 低濃度硫酸銅溶液連續(xù)藥浴治療效果

將人工感染眼點淀粉卵渦鞭蟲的卵形鯧鲹幼魚分別在0.2、0.4 mg·L?12個低質(zhì)量濃度硫酸銅溶液和自然海水中連續(xù)藥浴10 d (圖2)。結(jié)果顯示，對照組卵形鯧鲹在第2天出現(xiàn)死亡，并在第2、第3天連續(xù)死亡，在第3天死亡率達100%。0.2、0.4 mg·L?1硫酸銅溶液連續(xù)藥浴組卵形鯧鲹僅在第2、第3天出現(xiàn)死亡，死亡率分別為20%和10%，之后狀態(tài)穩(wěn)定未見患病癥狀，第10天取鰓觀察未發(fā)現(xiàn)蟲體。

圖2 不同處理組卵形鯧鲹的死亡率Figure 2 Mortality of T.ovatus in different groups

3 討論

水產(chǎn)養(yǎng)殖中，硫酸銅因成本低、有效性高等特點常被用于治療魚類真菌和寄生蟲性疾病且療效顯著[23]。研究表明，用100 mg·L?1的五水硫酸銅溶液處理斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus) 魚卵能有效控制水霉病且不會影響孵化率[26]；將患病魚在質(zhì)量濃度為1.5 mg·L?1的硫酸銅溶液中藥浴2 h，間隔1 d再以同劑量硫酸銅溶液藥浴1次，可有效治療梭鱸 (Sander lucioperca) 幼魚的車輪蟲病[27]；硫酸銅能有效治療養(yǎng)殖魚類淀粉卵渦鞭蟲病[22]。但是使用硫酸銅治療養(yǎng)殖魚類淀粉卵渦鞭蟲病的最低有效劑量和合理應(yīng)用方法尚未見報道。因此，優(yōu)化硫酸銅的使用濃度、最大程度地降低硫酸銅在使用過程中的毒性、提高治療效率并建立有效的方案來控制養(yǎng)殖魚類淀粉卵渦鞭蟲病具有重要意義。

本研究結(jié)果表明，眼點淀粉卵渦鞭蟲的渦孢子和營養(yǎng)體對硫酸銅敏感性強。用3.13、0.78、0.20 mg·L?1硫酸銅溶液分別藥浴處理10、30、60 min均可100%殺滅渦孢子；以2.0、1.0、0.5 mg·L?1硫酸銅溶液分別藥浴患病卵形鯧鲹幼魚2、4、8 h均可使?fàn)I養(yǎng)體完全脫落，幼魚患病癥狀消失，恢復(fù)正常。但在實驗中發(fā)現(xiàn)，眼點淀粉卵渦鞭蟲包囊對硫酸銅的耐受性強，在100 mg·L?1硫酸銅中連續(xù)藥浴仍能繼續(xù)分裂，這與Paperna[28]報道的10 mg·L?1硫酸銅藥浴處理不能有效阻止包囊分裂的結(jié)果一致。包囊耐受性強可能是導(dǎo)致淀粉卵渦鞭蟲病難以根治的主要原因[29]。徐紹剛等[21]在治療漠斑牙鲆 (Paralichthys lethostigma) 淀粉卵渦鞭蟲病時發(fā)現(xiàn)將病魚用淡水浸泡處理后魚體恢復(fù)正常，開始攝食，但幾天后又重復(fù)感染，且較上一次更加嚴重。硫酸銅在殺滅渦孢子和驅(qū)除魚體營養(yǎng)體方面效果顯著，但由于水體中過量的銅離子對養(yǎng)殖魚類及周圍環(huán)境具有很強的毒副作用，因此生產(chǎn)上不能為了治療淀粉卵渦鞭蟲病而盲目增加硫酸銅的使用劑量。

銅 (Cu) 元素參與魚體超氧化物歧化酶、細胞色素氧化酶、糖蛋白、血紅蛋白等物質(zhì)合成過程，是魚類生長和代謝必不可少的微量元素[30-31]。然而，水環(huán)境中銅離子濃度過高，會通過促進對細胞和生物體有毒的自由基的產(chǎn)生來破壞生物體正常的代謝功能，對水生生物具有致死性[23]。因此，科學(xué)使用硫酸銅、掌握淀粉卵渦鞭蟲生活史各個時期對硫酸銅溶液的敏感性，并在合適的時期利用最低有效濃度的硫酸銅溶液殺滅眼點淀粉卵渦鞭蟲具有重要意義。在使用硫酸銅治療魚類真菌和寄生蟲性疾病之前需要清楚水體中的銅離子對治療魚類的安全濃度。然而，水體中銅離子濃度受水質(zhì)特性的影響，尤其是溫度、pH、堿度、硬度和鹽度等，因此硫酸銅用量需根據(jù)水環(huán)境的具體情況而定[32-34]。硫酸銅對各水產(chǎn)動物的安全濃度存在差異，研究表明體質(zhì)量為 (8.6±0.3) g的斜帶石斑魚 (Epinephelus coioides)對硫酸銅的安全質(zhì)量質(zhì)量濃度為1.485 mg·L?1[35]；全長3～4 cm的斑石鯛 (Oplegnathus punctatus) 幼魚對硫酸銅的安全質(zhì)量濃度為 2.22 mg·L?1[36]。本實驗中體質(zhì)量為 (3.35±0.25) g 的卵形鯧鲹幼魚對硫酸銅的安全質(zhì)量濃度為43.06 mg·L?1，耐受性強，遠高于可有效殺滅自由游動的眼點淀粉卵渦鞭蟲渦孢子的質(zhì)量濃度。表明在有效的殺蟲濃度范圍內(nèi)，硫酸銅對卵形鯧鲹的毒性較小，不會引起中毒或死亡。

眼點淀粉卵渦鞭蟲是一種常見的魚類寄生蟲，對宿主沒有選擇特異性，幾乎可以感染生活環(huán)境下的所有魚類，具有環(huán)境適應(yīng)性強、發(fā)病速度快等特點，已被列入重要的海洋魚類病原[37-41]。消滅可在水中自由游動的渦孢子或使用藥物使?fàn)I養(yǎng)體從魚體脫落并大量換水，清除水體中的包囊，是目前防治淀粉卵渦鞭蟲病的重要策略。本研究根據(jù)硫酸銅體外殺滅包囊和渦孢子的實驗結(jié)果，創(chuàng)新性地將感染魚連續(xù)浸泡在質(zhì)量濃度為0.2、0.4 mg·L?1的硫酸銅溶液中，10 d后卵形鯧鲹幼魚未見患病癥狀，有明顯的療效，說明渦孢子從包囊中孵化后迅速被硫酸銅殺滅而未感染魚體。

綜上，卵形鯧鲹對硫酸銅的耐受性強，在有效殺蟲濃度范圍內(nèi)不會造成幼魚死亡。眼點淀粉卵渦鞭蟲在營養(yǎng)體和渦孢子階段對硫酸銅敏感，但發(fā)育形成包囊后對硫酸銅具有抗性，難以殺滅。故生產(chǎn)上可通過高質(zhì)量濃度 (2.0 mg·L?1) 硫酸銅溶液短時間 (2 h) 藥浴使?fàn)I養(yǎng)體從魚體脫落，再使用低質(zhì)量濃度 (0.2 mg·L?1) 硫酸銅溶液連續(xù)藥浴(10 d) 殺滅剛孵化的渦孢子，可有效治療卵形鯧鲹淀粉卵渦鞭蟲病。