漁用氧化劑對水源水和池塘水中磺胺類抗性基因sul1的去除作用

趙曉雨，蘇浩昌，徐 煜，徐武杰，胡曉娟，文國樑，曹煜成，余招龍

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地，廣東 深圳 518121； 4.廣東冠利海洋生物有限責(zé)任公司，廣東 茂名 525400）

抗生素的大量使用及其在生物體內(nèi)的不完全代謝使其在自然界水體環(huán)境中殘留[1-2]，并通過養(yǎng)殖水源水的傳播途徑進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)境，還可能誘導(dǎo)形成抗生素抗性菌 (Antibiotic resistant bacteria, ARB) 和抗性基因 (Antibiotic resistant genes, ARGs)。近年來，ARGs已成為環(huán)境中的新型污染物，其借助可移動遺傳元件轉(zhuǎn)移到病原菌的基因組中，使病原菌產(chǎn)生抗生素耐藥性，對養(yǎng)殖動物甚至人體健康造成潛在威脅[3-5]。因此，抗生素及其ARGs的環(huán)境殘留問題受到廣泛關(guān)注。黃志堅等[6]選取了139 株分離自水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌，對氟氯霉素、磺胺、鏈霉素和甲氧芐啶等多種抗生素的抗性基因進(jìn)行了特征分析，結(jié)果顯示上述ARGs在所測菌株中均被檢出。據(jù)Su等[7]和Wang等[8]報道，在中國南方對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)，sul1和cmlA等多種ARGs在養(yǎng)殖水源水、池塘水、底泥和對蝦腸道中均有檢出?？梢?，已有不同種類的ARGs在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中傳播。

有學(xué)者認(rèn)為造成水產(chǎn)品中抗生素抗性殘留的主要原因是未經(jīng)處理的養(yǎng)殖尾水在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被重復(fù)使用[9]?？茖W(xué)使用氧化劑對養(yǎng)殖水環(huán)境和相關(guān)設(shè)施進(jìn)行有效消毒，可防止水產(chǎn)病原菌積累，促進(jìn)養(yǎng)殖生物健康生長。漁用氧化劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用量大，且目前常用漁用氧化劑主要有氯制劑、溴制劑以及高錳酸鉀 (KMnO4)等[10]。漁用氧化劑中，含氯消毒劑 [ 次氯酸鈉 (NaClO) 和漂白粉等]價格較低、殺菌廣譜，其通過次氯酸的氧化作用對水體環(huán)境中的細(xì)菌起到殺滅作用；溴類消毒劑的主要作用成分是次溴酸，具有廣譜殺菌作用[10-11]；KMnO4是強(qiáng)氧化劑，溶于水后釋放新生態(tài)氧，使有機(jī)物氧化從而起到殺菌作用，在改良水質(zhì)方面也有很好的效果[12]。這些消毒劑因價格低廉、殺菌廣譜且高效，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛[11-12]。氧化劑對水體中微生物的不同細(xì)胞成分 (如氨基酸、脂類和核酸等) 的氧化能力存在較大差別，這也使得其對細(xì)胞內(nèi)抗性基因 (Intracellular antibiotic resistant genes,iARGs) 和細(xì)胞外抗性基因 (Extracellular antibiotic resistant genes, eARGs) 的去除作用差異顯著[13]。隨著qPCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，ARGs的檢測與定量不再受限于抗性菌的可培養(yǎng)性，該技術(shù)也被廣泛用于定量研究ARGs的去除[13-14]。近年來，城市污水處理領(lǐng)域的相關(guān)研究顯示，活性氯和臭氧等普通氧化劑以及紫外線或過渡金屬離子參與的高級氧化作用均對ARGs產(chǎn)生了較強(qiáng)的去除效果[13-18]。這表明氧化消毒技術(shù)可以有效去除并控制水環(huán)境中ARGs的傳播。

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中所用的氧化劑、消毒方法以及對水體環(huán)境的水質(zhì)需求，都與污水處理行業(yè)存在巨大差異，目前有關(guān)漁用氧化劑與消毒方法對水環(huán)境中ARGs的作用效果少見報道。對此，基于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中氧化消毒技術(shù)的生產(chǎn)實踐，本研究選用NaClO、二溴海因 (C5H6Br2N2O2) 和KMnO43種常用漁用氧化劑，探討其對養(yǎng)殖水源水和池塘體水中常見的磺胺類抗性基因sul1的去除作用，探討從源頭上控制水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs傳播的可行性，為今后進(jìn)一步建立養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量安全控制技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑和儀器 KMnO4，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉 (NaH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、硫代硫酸鈉 (Na2S2O3)、濃硫酸 (H2SO4)、無水乙醇 (C2H6O)、異丙醇 (C3H8O)均為分析純(AR)，購自廣州化學(xué)試劑廠。C5H6Br2N2O2(純度≥98%) 購自麥克林 (上海)。NaClO儲備液 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥7.5%) 購自廣州化學(xué)試劑廠，用于產(chǎn)生活性氯 (Free available chlorine, FAC)[14]。N,N'-二乙基-1,4-苯二胺硫酸鹽 (C10H18N2O4S, ≥98%) 和 2,2'-聯(lián)氨-雙 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二胺鹽 (C18H24N6O6S4,＞98%) 購自梯希愛 (上海) 化成工業(yè)發(fā)展有限公司。TB Green Real Time qPCR Kit 購自日本TaKaRa公司。Power Soil Kit購自美國MOBIO公司，十六烷基三甲基溴化銨 (C19H42BrN, ≥99%) 購自阿拉丁。實驗用水均為屈臣氏蒸餾水。實驗主要使用儀器為LightCycler 480實時熒光定量PCR儀 (Roche，瑞士)和紫外分光光度計(AOE instrument，上海)。

1.1.2 養(yǎng)殖水源水和池塘養(yǎng)殖水準(zhǔn)備 本實驗所使用的養(yǎng)殖水源水和池塘養(yǎng)殖水體，均采自廣東冠利海洋生物有限責(zé)任公司的集約化養(yǎng)殖基地。對采水器具進(jìn)行提前消毒并用水源水或池塘水清洗3次，從水源和對蝦養(yǎng)殖池塘選3個采水點，使用不銹鋼采水器采集水樣并分別混合到一起，裝入聚乙烯塑料桶中。用塑料瓶 (1 L) 收集采集到的水樣用于測定水質(zhì) (全程低溫放置至實驗室)。水源水和池塘水的pH值均為6.6，其氨氮亞硝酸鹽氮和總有機(jī)碳 (TOC) 質(zhì)量濃度見表1。

表1 水源水和池塘水中氨氮、亞硝酸鹽氮和總有機(jī)碳質(zhì)量濃度Table 1 Concentrations of NH4+ -N, NO2? -N and TOC in water source and pond water mg·L?1

1.2 實驗方法

1.2.1 氧化劑濃度的測定 根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中所使用漁用氧化劑的實際濃度范圍，將其使用質(zhì)量濃度設(shè)為15 mg·L?1。實驗前對所用KMnO4儲備液(5 g·L?1)、C5H6Br2N2O2儲備液 (0.2 g·L?1)和 NaClO儲備液 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥7.5%) 進(jìn)行有效濃度測定。其中，以ABTS分光光度法測定KMnO4濃度[19]和有效溴濃度[20]，以DPD分光光度法測定有效氯濃度[21]。

1.2.2 實驗分組與樣品采集 分別按養(yǎng)殖水源水和池塘水設(shè)置NaClO組、C5H6Br2N2O2組、KMnO4組和對照組，每組3個平行。對照組和實驗組分別為未添加任何氧化劑和添加相應(yīng)氧化劑的養(yǎng)殖水源水和池塘養(yǎng)殖水體。將測試的養(yǎng)殖水源水和池塘水分別注入滅菌的200 mL帶蓋圓口瓶中，采集實驗組和對照組中的樣品用于檢測各組中的初始eARGs和iARGs。隨后加入相應(yīng)的氧化劑并緩慢攪拌使其達(dá)到設(shè)定的初始濃度。實驗體系設(shè)為50 mL，環(huán)境溫度為25 ℃，樣品瓶置于暗處反應(yīng)2 h。取樣時間設(shè)為第5、第10、第30、第80和第120分鐘，測定各樣品瓶水體中的殘留氧化劑濃度，氧化劑作用效果以常用于消毒工程中的單位濃時積 (Cumulative integrated exposures, CT values) 表示[14]。反應(yīng) 2 h后，即時在水樣中加入大于氧化劑20倍摩爾濃度的 Na2S2O3溶液 (60 mmol·L?1) 中止反應(yīng)，并將水樣以0.22 μm孔徑濾膜過濾。所得濾膜與水樣置于?20 ℃保存，分別用于iARGs和eARGs檢測。

1.2.3 ARGs的檢測 以qPCR技術(shù)測定各樣品中ARGs的拷貝數(shù)，定量監(jiān)測sul1在漁用氧化劑作用下的含量變化。其中，用Power Soil Kit提取濾膜中的總DNA作為iARGs樣品。用CTAB法提取水樣中的總DNA作為eARGs樣品[22]。

所有樣品的qPCR檢測參考SYBR Green Real Time qPCR試劑盒、LightCycler 480熒光定量PCR儀的產(chǎn)品使用方法。本研究檢測的ARG為磺胺類抗性基因sul1，將克隆有目標(biāo)抗性基因的大腸桿菌(Escherichia coli) 標(biāo)準(zhǔn)菌株SR1在微生物培養(yǎng)箱(37 ℃) 中培養(yǎng)20 h，用天根質(zhì)粒提取試劑盒 (上海) 提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒并用NanoDrop2000測定提取質(zhì)粒的濃度以及純度。參照Wang等[8]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以及確定qPCR的反應(yīng)體系。目的基因的引物序列以及退火溫度見表2。反應(yīng)結(jié)束后，查看熔解曲線以確定檢測的為目標(biāo)基因，查看擴(kuò)增曲線的反應(yīng)效率，獲得目標(biāo)基因拷貝數(shù)，并換算為所測樣品中目標(biāo)基因的絕對濃度(拷貝·mL?1)。

表2 qPCR所需引物Table 2 Primers used for quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

濃時積和對數(shù)去除值的計算公式為[17]：濃時積(mg·L?1·min) =氧化劑質(zhì)量濃度 (mg·L?1)×反應(yīng)時間(min)；對數(shù)去除值 (拷貝·mL?1) =log(C0·C?1)。其中，C0為反應(yīng)開始時ARGs的濃度，C為反應(yīng)結(jié)束時的濃度。

以Excel 2010軟件繪制圖表。圖中數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)”表示，采用SPSS 22.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種漁用氧化劑對ARGs的去除效果

sul1在水源水和池塘水中檢出量均較高。水源水中細(xì)胞內(nèi)sul1 (i-sul1) 濃度和細(xì)胞外sul1 (e-sul1)濃度分別約為 2.67×105和 1.15×105拷貝·mL?1。漁用氧化劑作用2 h后，水源水中的i-sul1和e-sul1均有不同程度的去除。其中i-sul1的去除效果為NaClO 組 (1.2 log,P＜0.05) ＞C5H6Br2N2O2組 (0.4 log,P＜0.05) ＞KMnO4組 (0.2 log,P=0.184) (圖1-a)。e-sul1的去除效果為NaClO組 (1.4 log,P＜0.01)=C5H6Br2N2O2組 (1.4 log,P＜0.01) ＞KMnO4組(1.3 log,P＜0.01) (圖1-b)。

池塘水中細(xì)胞內(nèi)i-sul1和e-sul1濃度分別約為3.57×106和 7.88×104拷貝·mL?1。漁用氧化劑作用2 h后，池塘水中的i-sul1和e-sul1均有不同程度的去除。其中，僅NaClO組表現(xiàn)出對池塘水中isul1的去除能力，對應(yīng)的對數(shù)去除值為1.3 log(P＜0.01，圖2-a)。e-sul1的去除效果為KMnO4組(1.2 log,P＜0.01) ＞NaClO組 (0.5 log,P=0.065) ＞C5H6Br2N2O2組 (0.1 log,P=0.751，圖2-b)。

圖1 消毒前后水源水中i-sul1 (a) 和e-sul1 (b) 濃度的變化同一圖中標(biāo)有不同字母代表有顯著差異 (P＜0.05)；圖2同此Figure 1 Change in concentrations of i-sul1 (a) and e-sul1 (b) in water source before and after disinfectionDifferent letters in the same figure indicate significant difference (P＜0.05).The same case in Figure 2.

圖2 消毒前后池塘水中i-sul1 (a) 和e-sul1 (b) 濃度的變化Figure 2 Change in concentrations of i-sul1 (a) and e-sul1 (b) in pond water before and after disinfection

2.2 漁用氧化劑在養(yǎng)殖水源水和池塘水中的濃度變化

在水源水和池塘水中，活性氯的質(zhì)量濃度在初始階段變化最快。反應(yīng)5 min時，活性氯在水源水和池塘水中的質(zhì)量濃度分別降低了72%和66%(圖3-a)；2 h后活性氯濃度僅為其初始濃度的12%(1.8 mg·L?1，水源水) 和 3% (0.4 mg·L?1，池塘水)。過程中活性氯在水源水中所達(dá)到的最高CT值(215.3 mg·L?1·min) 為池塘水中相應(yīng)值 (75.2 mg·L?1·min)的 2.86 倍 (圖3-b)。

圖3 消毒過程中活性氯質(zhì)量濃度 (a) 及其所達(dá)到的濃時積 (b) 的變化Figure 3 Change in concentration of FAC (a) and reached CT value (b) during disinfection

KMnO4的質(zhì)量濃度在初始階段變化最快。反應(yīng)5 min時，KMnO4在水源水和池塘水中的質(zhì)量濃度分別降低了 18% (2.3 mg·L?1) 和 30% (4.5 mg·L?1，圖4-a)；2 h后KMnO4質(zhì)量濃度為其初始濃度的61% (9.1 mg·L?1，水源水) 和 46% (6.9 mg·L?1，水源水)。相較于活性氯，KMnO4在養(yǎng)殖水體系中均能保持較高濃度，且其在水源水中所能達(dá)到的最高 CT 值 (1 095.9 mg·L?1·min) 為池塘水中相應(yīng)值(825.2 mg·L?1·min) 的 1.33 倍 (圖4-b)。

圖4 消毒過程中高錳酸鉀質(zhì)量濃度 (a) 及其所達(dá)到的濃時積 (b) 的變化Figure 4 Change in concentration of KMnO4 (a) and reached CT value (b) during disinfection

3 討論

3.1 漁用氧化劑對iARGs和eARGs的去除效果

氧化劑被廣泛用于殺菌消毒和改善水質(zhì)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮著重要作用。本研究選用3種常用的漁用氧化劑NaClO、C5H6Br2N2O2和KMnO4，研究了其在養(yǎng)殖相關(guān)水環(huán)境中對ARGs (iARGs和eARGs) 的去除作用。結(jié)果顯示，水源水和池塘水中i-sul1濃度遠(yuǎn)高于e-sul1 (P＜0.01)，說明養(yǎng)殖相關(guān)的水環(huán)境中，i-sul1是水環(huán)境中sul1的主要存在形式，抗性菌是sul1在水環(huán)境中傳播的主要介質(zhì)，這與Mao等[24]報道的多種自然水體環(huán)境中iARGs濃度遠(yuǎn)高于eARGs濃度的結(jié)果一致，可見，盡管eARGs不容忽視，但養(yǎng)殖水環(huán)境中ARGs的去除主要取決于iARGs的去除。Jeon等[25]研究表明池塘養(yǎng)殖環(huán)境中的和有機(jī)質(zhì)等還原性物質(zhì)均會與次氯酸和次溴酸反應(yīng)生成氯胺(NH2Cl)、溴胺 (NH2Br) 及有機(jī)氯 (溴) 化物，且其過程的反應(yīng)速率 (高水平) 快于DNA與氧化劑的反應(yīng)速率 (中等水平)，從而對所添加的氧化劑造成消耗，高錳酸鉀也會與無機(jī)氮和醇、醛、酯、酸等多種有機(jī)物反應(yīng)且被廣泛用于水環(huán)境中污染物的去除[26]。有研究報道，污水體系中上述還原性物質(zhì)含量顯著影響ARGs的氧化去除效率[17]。表1顯示池塘水中還原性物質(zhì)濃度高于水源水，表明池塘水還原性強(qiáng)于水源水。此外，化學(xué)需氧量 (COD) 是衡量水環(huán)境還原性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，是特定條件下水環(huán)境中還原性物質(zhì)的需氧量。COD可由水環(huán)境中KMnO4的消耗量換算為O2的消耗量得出，此情況下其被稱為KMnO4指數(shù)。在本研究的養(yǎng)殖水體系中，水源水中KMnO4消耗量 (5.9 mg·L?1)低于池塘水 (8.1 mg·L?1)，這間接反映了COD的高低，從而也表明池塘水還原性強(qiáng)于水源水。

標(biāo)準(zhǔn)電極電勢數(shù)據(jù) (25 ℃) 表明：Mn7+/Mn4+(1.68 V) ＞ Cl+/Cl?(1.48 V) ＞ Br+/Br?(1.33 V)，故本研究所選3種氧化劑中，次氯酸的氧化性強(qiáng)于次溴酸，且Mn7+氧化能力最強(qiáng)。水源水和池塘水中，NaClO對i-sul1的去除效果強(qiáng)于C5H6Br2N2O2和KMnO4[水源水 (1.2 log＞0.4 log＞0.2 log) 和池塘水(1.3 log＞0 log)]，i-sul1位于抗性菌內(nèi)，因此漁用氧化劑必須首先作用于細(xì)胞且進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才可與其反應(yīng)?；钚月扰c細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的多種物質(zhì)都有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，同時它還可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，而不會造成顯著的細(xì)胞膜損傷[27]，這保證了其對iARGs的去除效果。C5H6Br2N2O2的主要活性成分為次溴酸，其與NaClO同屬鹵素類消毒劑，雖性質(zhì)相似，但次溴酸氧化能力弱于次氯酸，這可能是本研究中其對ARGs的去除能力低于NaClO的原因。雖然Mn7+/Mn4+氧化還原電勢最高，但其氧化性在酸性條件下較強(qiáng)且受體系pH影響最大 (由能斯特方程得出)。本研究中氧化作用在接近于中性的體系中進(jìn)行 (所選水源水和池塘水的pH均為6.6)，這解釋了本研究中KMnO4對i-sul1的去除效果最弱的原因，說明其在養(yǎng)殖水體系中對細(xì)胞內(nèi)抗性基因的氧化能力較弱。

在水源水中，漁用氧化劑NaClO、C5H6Br2N2O2和KMnO4均對e-sul1有較強(qiáng)的去除效果 (1.4 log、1.4 log和1.3 log)；在池塘水中，NaClO和C5H6Br2N2O2對e-sul1的去除效果相對較弱 (分別為0.5 log和0.1 log)，而KMnO4對e-sul1的去除效果為1.2 log，顯著強(qiáng)于另外兩種漁用氧化劑 (P＜0.05)。這表明池塘水中還原性較強(qiáng)的特點并未影響KMnO4對eARGs的去除效果，卻顯著減弱了NaClO和C5H6Br2N2O2對eARGs的去除效果。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，KMnO4不僅可以滅活微生物，還有促進(jìn)絮凝、改善水質(zhì)的作用[12]，這是因為KMnO4氧化還原性物質(zhì)的過程會生成促凝劑，其主要包括二氧化錳 (MnO2) 或水合氧化錳等一些錳氧化物[28]，這些促凝劑會增強(qiáng)KMnO4對污染物的去除作用。有研究報道，KMnO4在中性條件下會生成溶解性較低且吸附作用強(qiáng)的水合MnO2膠體，使得該條件下水環(huán)境中有機(jī)污染物的去除效果超過50%，明顯優(yōu)于酸性或堿性條件下的相應(yīng)效果[26]。Zhang等[15]的研究也表明KMnO4單獨(dú)作用對ARGs無去除效果，而錳氧化物的絮凝作用和KMnO4的氧化作用相結(jié)合時，卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的ARGs去除效果 (0.6～4.23 log)。故本研究所選養(yǎng)殖水中還原性物質(zhì)含量較高的特點有利于KMnO4對ARGs的去除，這可能是KMnO4在還原性較強(qiáng)的池塘水中仍能有效去除e-sul1的原因，也是與NaClO和C5H6Br2N2O2相比，KMnO4去除eARGs過程的特點。然而本研究的KMnO4組中，i-sul1的去除效果弱于e-sul1，這也與Zhang等[15]的結(jié)論一致，這可能與細(xì)胞結(jié)構(gòu)對iARGs的保護(hù)作用有關(guān)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 消毒過程中漁用氧化劑濃時積的變化

從消毒劑濃度變化的角度看，反應(yīng)2 h后池塘水中活性氯質(zhì)量濃度僅為0.4 mg·L?1，而水源水中則為1.8 mg·L?1，說明活性氯在池塘水中的消耗大于其在水源水中的消耗，這可能與池塘水還原性較強(qiáng)有關(guān) (表2)?；钚月仍谶€原性較弱的水源水中所達(dá)到的最高濃時積約為池塘水中相應(yīng)值的2.86倍(P＜0.05)，說明其濃時積受水環(huán)境還原性影響顯著。水處理工藝中常規(guī)氯化作用濃時積范圍為10～100 mg·L?1·min (25 ℃)[13]，而水產(chǎn)養(yǎng)殖研究領(lǐng)域暫未見關(guān)于消毒過程中濃時積的相關(guān)報道，本研究中初始質(zhì)量濃度為15 mg·L?1的活性氯在水源水和池塘水中達(dá)到的濃時積范圍遠(yuǎn)高于污水處理 (75.2～215.3 mg·L?1·min)。有研究顯示，在還原性弱的中性磷酸鹽緩沖液體系中，上述濃時積范圍內(nèi)的氯化作用對ARGs去除效果可達(dá)到4 log[17-18]。而還原性強(qiáng)的污水體系中ARGs的去除效果相對較低，15 mg·L?1活性氯對城市污水體系中e-amp和iamp的去除效果為 1～1.5 log，且 12.5 mg·L?1以上的活性氯才對eARGs和iARGs均有去除效果[17]；15 mg·L?1活性氯對另一污水體系中i-sul1的去除效果僅為0.19～0.27 log，所對應(yīng)的CT值卻高達(dá)450 mg·L?1·min[29]。以上研究表明，不同的水介質(zhì)由于還原性不同，氧化作用對ARGs的去除效果及其對應(yīng)的濃時積也不同。本研究中NaClO在水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)的水環(huán)境中也可去除eARGs (0.5～1.4 log)和iARGs (1.2～1.3 log)，其效果與對應(yīng)的CT值可為實際養(yǎng)殖中的消毒過程提供參考。

養(yǎng)殖水中C5H6Br2N2O2的濃度未被檢出，但其僅在還原性較弱的水源水中表現(xiàn)出較強(qiáng)的ARGs去除效果 (0.4～1.4 log)，表明其可能在還原性強(qiáng)的池塘水中被迅速消耗。盡管有研究報道10 mg·L?1的C5H6Br2N2O2可有效滅活養(yǎng)殖水環(huán)境中的細(xì)菌和弧菌[30]，但本研究表明 15 mg·L?1的 C5H6Br2N2O2對池塘水中ARGs的去除能力有限。與NaClO組一致，KMnO4在兩種體系中的濃時積值差異顯著(P＜0.05)，但均持續(xù)升高，最高值僅相差1.33倍(差異小于NaClO組對應(yīng)的2.86倍)，這與Fan等[31]的研究結(jié)果一致，說明其氧化性受還原性物質(zhì)的影響小于NaClO，其氧化持久性的特點有利于其對養(yǎng)殖水中的eARGs表現(xiàn)出更強(qiáng)的去除作用。

此外，反應(yīng)第2小時氧化劑的濃度已趨于穩(wěn)定，按照其此時的消耗量，水源水和池塘水中所需的活性氯質(zhì)量濃度需分別高于13.2和14.6 mg·L?1，所需的KMnO4質(zhì)量濃度需分別高于5.9和8.1 mg·L?1。這有助于氧化劑游離活性成分的產(chǎn)生 (如發(fā)生折點氯化作用)，從而實現(xiàn)更好的ARGs氧化去除效果。從該角度看，對于所選質(zhì)量濃度15 mg·L?1，兩種體系中NaClO的劑量適中，而KMnO4劑量則相對過高。結(jié)合本研究中氧化劑去除ARGs效果，養(yǎng)殖清塘中可使用價格較低、效果較好的含氯氧化劑去除ARGs，但本研究表明其濃時積受水體還原性影響較大 (相差2.86倍)，在池塘水中需要過量使用以達(dá)到持久氧化的效果。KMnO4在清塘環(huán)節(jié)可以持久、有效地去除eARGs，從而切斷其水平傳播途徑，且KMnO4濃時積受水體還原性影響較小 (相差1.33倍)，無需過量使用。

3.3 影響?zhàn)B殖水環(huán)境中ARGs去除的因素

首先，本研究所用氧化劑的質(zhì)量濃度均為15 mg·L?1，通常的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，在苗種放養(yǎng)前的清塘消毒環(huán)節(jié)會使用到如此高濃度的氧化劑，即利用漁用氧化劑去除養(yǎng)殖水環(huán)境中的ARGs可以在清塘環(huán)節(jié)實現(xiàn)，且選擇含氯氧化劑效果更佳[32]。此外，本研究表明NaClO和C5H6Br2N2O2在水源水環(huán)境中可有效去除iARGs (0.4～1.2 log) 和eARGs(1.4 log)，即養(yǎng)殖前使用高濃度鹵族氧化劑對水源水進(jìn)行消毒可實現(xiàn)從水源途徑控制ARGs的傳播。而在池塘水環(huán)境中，NaClO對iARGs和eARGs的去除效果均較好，故而應(yīng)被選用。其次，本研究表明水源水和池塘水體系還原性的不同影響了ARGs的去除效果，強(qiáng)還原性減弱了NaClO和C5H6Br2N2O2對eARGs的去除效果，但有利于KMnO4去除eARGs。所以，在考慮ARGs的去除時，計算氧化劑實際用量時應(yīng)將環(huán)境中還原性物質(zhì)的影響考慮在內(nèi)。使用含氯氧化劑前，可以采取一些措施 (如預(yù)氧化、增氧和曝氣等) 盡可能降低養(yǎng)殖水中的還原性，使得ARGs的去除效果更佳，另外還可以結(jié)合KMnO4的持久氧化作用更好地去除eARGs。再者，本研究表明iARGs為ARGs的主要存在形式，因此應(yīng)將iARGs的去除作為控制ARGs在養(yǎng)殖水環(huán)境中傳播的重要因素。

水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其水質(zhì)和底質(zhì)的環(huán)境狀況和生物群落組成等因素有可能影響氧化劑去除ARGs的效果，ARGs在不同環(huán)境條件下的響應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。