擬穴青蟹對(duì)餌料中穩(wěn)定同位素富集效應(yīng)的初步研究

黃國強(qiáng)，曹素會(huì)，劉旭佳，彭銀輝，劉永宏，黃亮華，鐘聲平

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西 南寧 530200； 2.廣西科學(xué)院廣西北部灣海洋研究中心/廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007； 3.北部灣大學(xué)海洋學(xué)院/廣西海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535011）

我國大陸東南沿海分布有鋸緣青蟹 (Scylla serrata)、紫螯青蟹 (S.tranquebarica)、擬穴青蟹(S.paramamosain)、欖綠青蟹 (S.olivacea) 4種青蟹，其中擬穴青蟹分布最廣且數(shù)量最多[1]。青蟹既是我國東南沿海重要的養(yǎng)殖蟹類[2]，也是紅樹林和河口區(qū)域的重要捕食者。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)不僅可以為擬穴青蟹提供棲息和庇護(hù)場(chǎng)所，紅樹林內(nèi)及周邊生長的動(dòng)植物還能為其提供豐富的餌料。已有研究表明，紅樹林區(qū)域野生青蟹的餌料主要由海洋來源的碎屑、貝類、甲殼類、魚類組成，不同組分的占比在不同地點(diǎn)有明顯差異[3]。國內(nèi)對(duì)擬穴青蟹天然餌料來源的報(bào)道較少，主要原因可能是青蟹攝食時(shí)將食物用大螯抱握或夾碎后，再經(jīng)過大顎切碎后攝入，大部分餌料的外形結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，因而難以用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行鑒定和定量。相比之下，穩(wěn)定同位素技術(shù)由于不需要對(duì)難以辨認(rèn)的餌料碎片進(jìn)行鑒定分類，被廣泛應(yīng)用于水生生物的餌料組成和營養(yǎng)來源研究[4-8]，進(jìn)而應(yīng)用于海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)的食物網(wǎng)構(gòu)建[9-13]和營養(yǎng)級(jí)分析[9-10,14-16]，也用于分析水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖生物的餌料組成和營養(yǎng)來源[17-20]。

應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)分析餌料和營養(yǎng)來源，需要一個(gè)判別值用于模型計(jì)算。一般而言，動(dòng)物與其食物之間存在較為明確的判別值，碳穩(wěn)定同位素判別值 (Δ13C) 介于0‰～1‰，氮穩(wěn)定同位素判別值(Δ15N) 介于 3‰～4‰[21-22]，但不同生物類群或生活環(huán)境之間存在較大差異，例如在紅樹林及近海灘涂，由于其環(huán)境獨(dú)特且復(fù)雜，穩(wěn)定同位素的富集與其他區(qū)域可能有較大差別。Yokoyama等[23]對(duì)河口大型底棲動(dòng)物的研究結(jié)果表明動(dòng)物-食物的Δ13C達(dá)到2‰～2.2‰。而澳大利亞紅樹林中的底棲動(dòng)物穩(wěn)定碳同位素 (δ13C) 甚至比紅樹植物還低3‰～4‰[24]。因此，如果要利用穩(wěn)定同位素研究動(dòng)物食物來源和營養(yǎng)關(guān)系，需要通過更多的室內(nèi)喂養(yǎng)控制實(shí)驗(yàn)來測(cè)定動(dòng)物與其食物之間的穩(wěn)定同位素判別值[25]。擬穴青蟹對(duì)不同餌料的穩(wěn)定同位素富集效應(yīng)尚未見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定同位素技術(shù)，測(cè)定北海近海擬穴青蟹對(duì)紅樹林及鄰近灘涂5種近海天然餌料和養(yǎng)殖的雙齒圍沙蠶 (Perinereis aibuhitensis)的富集效應(yīng)，獲得擬穴青蟹與不同生物餌料的穩(wěn)定同位素判別值，為開展青蟹在紅樹林近海的食物鏈與營養(yǎng)來源分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)施

實(shí)驗(yàn)采用60個(gè)透明塑料整理箱 (長、寬和高分別為50、40和40 cm)，在室內(nèi)車間將養(yǎng)殖青蟹、經(jīng)過消毒的塑料整理箱用淡水清洗后加入1/3深度的沙濾海水，每個(gè)養(yǎng)殖箱配置1個(gè)氣石保持微量充氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)用水

實(shí)驗(yàn)用水是經(jīng)過砂濾和紫外線消毒的育苗用海水，鹽度26～30，pH 7.9～8.3，持續(xù)充氣保持溶解氧質(zhì)量濃度＞5.0 mg·L?1。

1.3 蟹苗來源

實(shí)驗(yàn)以廣西壯族自治區(qū)海洋研究所繁育的2期擬穴青蟹仔蟹為材料，挑選健康仔蟹200只，用容量為2 L的塑料桶，底部鋪沙1 cm，經(jīng)單獨(dú)隔離用對(duì)蝦飼料投喂30 d，體質(zhì)量達(dá)到0.5～1.2 g后作為實(shí)驗(yàn)用蟹苗。

1.4 餌料

實(shí)驗(yàn)采用犬牙珠鰕虎魚 (Acentrogobius caninus)、李氏? (Callionymus richardsoni)、須赤蝦 (Metapenaeopsis barbata)、雜色蛤 (Ruditapes philippinarum)、多齒圍沙蠶 (P.nuntia) 和雙齒圍沙蠶作為餌料，這6種餌料除了雙齒圍沙蠶為養(yǎng)殖種類外，其余為北部灣近海分布的底棲性海洋生物，均是擬穴青蟹潛在的餌料來源。選擇養(yǎng)殖的雙齒圍沙蠶作為實(shí)驗(yàn)餌料，是由于其穩(wěn)定同位素含量可能與天然餌料差別較大，對(duì)青蟹穩(wěn)定同位素富集可能產(chǎn)生影響。所有餌料在實(shí)驗(yàn)開始前從沿海同一地點(diǎn)收集足夠?qū)嶒?yàn)期間使用的數(shù)量，用經(jīng)砂濾的海水養(yǎng)殖24 h后，根據(jù)每天投喂量分袋分裝后冷凍保存待用。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用60個(gè)塑料整理箱進(jìn)行，采用完全隨機(jī)排列方式分配至6種餌料處理，每種餌料分別用10 個(gè)整理箱作為10個(gè)重復(fù)，每個(gè)箱養(yǎng)殖青蟹1只。

1.6 青蟹放養(yǎng)與采樣

養(yǎng)殖箱準(zhǔn)備安排完成后，從培育的200只蟹苗中隨機(jī)抽取60只，稱體質(zhì)量后放入養(yǎng)殖箱，并做好相關(guān)數(shù)據(jù)記錄。剩余的青蟹按每袋15只隨機(jī)抽取6袋作為初始樣品。

1.7 日常管理

青蟹每天投喂1次。把餌料從冰箱取出，自然解凍后，魚類去除頭部和骨骼的整個(gè)軀體肌肉作為餌料，蝦類餌料取去除頭部和外殼的整個(gè)軀體肌肉作為餌料，貝類去殼后的整個(gè)軟體部作為餌料，沙蠶取整條作為餌料，根據(jù)青蟹每天攝食量將餌料剪成適當(dāng)?shù)男K，稱質(zhì)量后投喂。每天投餌前將擬穴青蟹殘餌從水中撈出。隔天換水1次，每次換水100%。海水在室內(nèi)水泥池儲(chǔ)存，以保持與養(yǎng)殖箱溫度基本一致。

1.8 樣品處理與測(cè)定

66 d實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖期結(jié)束后，青蟹經(jīng)24 h停食，用紗布吸干表面水分，稱體質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。然后每只青蟹作為一個(gè)結(jié)束樣品。青蟹初始樣品和所有結(jié)束樣品在烘箱中以70 ℃烘干至恒質(zhì)量，然后用粉碎機(jī)粉碎，將粉碎后的樣品過100目篩后，再用濃鹽酸熏蒸除去無機(jī)碳。魚類餌料以去除頭部和骨骼的整個(gè)軀體肌肉作為樣品，每份樣品取15尾，每種魚取6份樣品；蝦類餌料取去除頭部和外殼的整個(gè)軀體肌肉作為樣品，每份樣品為30尾，共取6份樣品；貝類餌料取去殼后的整個(gè)軟體部作為樣品，每份樣品取30只，共取6份樣品；沙蠶取整條作為樣品，每份由樣品30條沙蠶混合，每種沙蠶取6份樣品。餌料樣品與青蟹樣品的烘干、粉碎、過篩和鹽酸熏蒸處理方法一致。處理好的樣品送中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀 (Isoprime-100同位素質(zhì)譜儀) 測(cè)定碳和氮穩(wěn)定同位素含量。

粒粒戴著大圍巾和帽子，穿了雙排扣收腰大衣，舉著相機(jī)不停地拍，拍樹，拍行人，連電線桿子都拍了，拍著拍著，一個(gè)黑色的身影閃進(jìn)鏡頭里，用一雙眼睛盯住粒粒的鏡頭。粒粒嚇了一跳，急忙移開相機(jī)，抬起頭。

1.9 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

青蟹成活率 (Survival rate, SR, %)和體質(zhì)量增長率 (Weight gain rate, WGR, %) 計(jì)算公式為：

式中IW和FW分別為實(shí)驗(yàn)開始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)青蟹體質(zhì)量 (g)。

青蟹對(duì)不同餌料中穩(wěn)定碳和氮同位素的富集效應(yīng)計(jì)算公式為：

式中δ13C和δ15N為樣品中穩(wěn)定碳和氮同位素的比值 (‰)。

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。因本文計(jì)算的成活率、生長率和特定生長率均為百分?jǐn)?shù)且變動(dòng)范圍較大，故進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、成活率和體質(zhì)量增長率

2.2 不同餌料的δ13C和δ15N

實(shí)驗(yàn)中使用的6種餌料δ13C和δ15N都存在顯著差異。6種餌料的δ15N介于7.78‰～15.38‰，其中魚類和多齒圍沙蠶的δ15N顯著高于其他餌料，雜色蛤和雙齒圍沙蠶的δ15N較低 (圖2-a)。6種餌料的δ13C介于?22.90‰～?14.96‰，其中雜色蛤和雙齒圍沙蠶的δ13C較低，李氏?和須赤蝦的δ13C較高 (圖2-b)。

圖1 投喂不同餌料的青蟹的初始體質(zhì)量、結(jié)束體質(zhì)量、成活率和體質(zhì)量增長率方柱上不同字母表示差異顯著 (P＜0.05)，后圖同此Figure 1 Initial mass, final mass, survival rate and weight gain rate of S.paramamosain fed with different diets Different lowercase letters on the columns indicate significant difference (P＜0.05).The same case in the following figures.

圖2 不同餌料的穩(wěn)定碳和氮同位素Figure 2 δ13C and δ15N of different diets

2.3 攝食不同餌料青蟹的δ13C和δ15N

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)青蟹的δ13C和δ15N分別為?21.13‰和5.24‰。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)攝食不同餌料的青蟹體內(nèi)δ13C和δ15N也出現(xiàn)顯著差異，δ15N有較大幅度的提高 (圖3-a)，δ13C也有不同幅度的增加 (圖3-b)。攝食李氏?、須赤蝦和多齒圍沙蠶的青蟹δ13C最高 (圖3-b)，攝食李氏?和須赤蝦的青蟹δ15N最高(圖3-a)。

圖3 初始和攝食不同餌料青蟹的穩(wěn)定碳和氮同位素Figure 3 δ13C和δ15N of initial S.paramamosain and S.paramamosain fed with different diets

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)青蟹的δ13C與初始相比有顯著提高，但攝食雜色蛤和雙齒圍沙蠶的提高幅度顯著低于攝食其余4種餌料的青蟹。攝食不同餌料的青蟹體內(nèi)δ15N較初始時(shí)也有大幅度提高，其中攝食雜色蛤和雙齒圍沙蠶的升幅較小 (圖4)。

圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)青蟹穩(wěn)定碳和氮同位素含量與初始青蟹的差值Figure 4 Difference of δ13C和 δ15 N of S.paramamosain at end and beginning of experiment

2.4 青蟹對(duì)餌料中δ15N和δ13C的富集效應(yīng)

青蟹對(duì)所攝餌料的δ15N和δ13C表現(xiàn)出不同的富集效應(yīng)。攝食6種餌料的青蟹Δ13C分別為0.7、?0.19、0.22、2.58、?0.12、2.75，Δ15N 介于?2.98～0.21 (圖5)。其中攝食犬牙珠鰕虎魚、李氏?和多齒圍沙蠶的青蟹對(duì)δ15N表現(xiàn)出明顯的負(fù)富集效應(yīng)，攝食雜色蛤和雙齒圍沙蠶的青蟹對(duì)δ15N表現(xiàn)出小幅度的富集效應(yīng)；攝食雜色蛤和雙齒圍沙蠶的青蟹對(duì)δ13C的富集幅度較大，攝食其余4種餌料的富集效應(yīng)較小或表現(xiàn)為小幅度的負(fù)富集。

圖5 青蟹對(duì)不同餌料中穩(wěn)定碳和氮同位素的富集效應(yīng)Figure 5 Enrichment of δ13C和 δ15 N in S.paramamosain fed with different diets

2.5 Δ15N和Δ13C與體質(zhì)量增長率的關(guān)系

對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的穩(wěn)定同位素富集效應(yīng)與體質(zhì)量增長率的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，未發(fā)現(xiàn)δ13C的富集效應(yīng)與體質(zhì)量增長率有明顯關(guān)系，但δ15N的富集效應(yīng)與體質(zhì)量增長率有顯著相關(guān)性，其關(guān)系可用對(duì)數(shù)函數(shù)Δ15N=3.496 6 ln(WGR)?17.934 (R2=0.857)來描述 (圖6)，表明實(shí)驗(yàn)期間δ15N的富集效應(yīng)隨著體質(zhì)量增長率的增加呈非線性的增長。

圖6 氮穩(wěn)定同位素的富集效應(yīng)與體質(zhì)量增長率的關(guān)系Figure 6 Regression relation between Δ15N and weight gain rate of S.paramamosain

3 討論

3.1 養(yǎng)殖效果

本實(shí)驗(yàn)提供的6種近海灘涂天然餌料中，雜色蛤、雙齒圍沙蠶和須赤蝦對(duì)青蟹的養(yǎng)殖效果較好，體質(zhì)量增長率明顯高于2種魚類，表明雙殼類、多毛類和小型甲殼類更符合擬穴青蟹的營養(yǎng)需求。有研究表明，紅樹林區(qū)域野生青蟹的餌料中甲殼類、貝類、多毛類占比居前三位[3]。青蟹的這種生長表現(xiàn)表明這幾類餌料能夠較好地滿足其營養(yǎng)需求，這可能是天然環(huán)境中青蟹以雙殼類、甲殼類和多毛類為主要餌料的原因之一。

3.2 穩(wěn)定同位素的富集效應(yīng)

紅樹林及近海灘涂是多種底棲魚類、甲殼類、貝類、多毛類等小型動(dòng)物的棲息場(chǎng)所，可為青蟹提供豐富的餌料。近年，國內(nèi)學(xué)者也嘗試研究擬穴青蟹的穩(wěn)定同位素特征，并據(jù)此為分析紅樹林與擬穴青蟹間的相互作用提供參考。Wang 等[26]通過分析紅樹葉和青蟹體內(nèi)的δ13C，發(fā)現(xiàn)海南島的紅樹林為擬穴青蟹提供了重要的營養(yǎng)來源。由于青蟹養(yǎng)殖過程中投喂的餌料種類較單一，而野生青蟹的餌料種類多樣，這可能導(dǎo)致養(yǎng)殖青蟹的碳、氮穩(wěn)定同位素組成與野生青蟹有明顯的差異[27]，因此可以通過分析青蟹的碳、氮穩(wěn)定同位素組成來鑒別野生青蟹和養(yǎng)殖青蟹。

國外學(xué)者通過測(cè)定紅樹林中3種擬相手蟹(Parasesarma erythrodactyla、Paragrapsus laevis、Helograpsus haswellianus) 的穩(wěn)定碳和氮同位素比率發(fā)現(xiàn)，這3種蟹的碳和氮主要來源不是紅樹林初級(jí)生產(chǎn)力[23]，而其他的研究發(fā)現(xiàn)紅樹林的初級(jí)生產(chǎn)力能夠?yàn)槠渲猩畹男奉愄峁┹^多的碳和氮營養(yǎng)來源[28-29]，不同研究所得結(jié)論不一致，可能是由不同區(qū)域紅樹林生態(tài)系統(tǒng)存在較大差別所致，也可能與不同研究采用的判別值是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值而不是實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值有關(guān)。

在應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)研究食物鏈和食物網(wǎng)時(shí)，動(dòng)物與其食物之間的判別值Δ13C介于0‰～1‰，Δ15N介于3‰～4‰[20-21]，也有學(xué)者認(rèn)為捕食者對(duì)食物的碳、氮穩(wěn)定同位素富集效應(yīng)分別為：Δ13C 為 1‰～2‰，Δ15N 為 2‰～3‰[30-31]。但對(duì)河口動(dòng)物而言，Δ13C超過2‰甚至比河口紅樹植物低也有報(bào)道[22-23]，如Yokoyama等[23]對(duì)河口大型底棲動(dòng)物的研究結(jié)果表明動(dòng)物-食物的Δ13C介于2‰～2.2‰，而相手蟹 (Episesarma singaporense和E.versicolor) 對(duì)紅樹植物葉子的Δ13C甚至可以達(dá)到5.1‰和4.1‰[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)擬穴青蟹體內(nèi)δ13C和δ15N含量相比人工飼料投喂的初始青蟹有大幅提高，但從對(duì)δ13C的富集效應(yīng)看，攝食李氏?和多齒圍沙蠶的青蟹Δ13C為負(fù)數(shù)，攝食雜色蛤和雙齒圍沙蠶的青蟹Δ13C明顯高于2‰，僅攝食犬牙珠鰕虎魚和須赤蝦的青蟹Δ13C介于0‰～1‰。青蟹對(duì)15N的Δ15N則與2‰～3‰的差距更大，大多數(shù)種類的富集效應(yīng)為負(fù)數(shù)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因可能是由于本實(shí)驗(yàn)在冬季進(jìn)行，溫度較低，青蟹生長較慢，體質(zhì)量增長率不高，體內(nèi)碳和氮尚未能從餌料中得到完全更新，盡管青蟹δ13C和δ15N有大幅度增加，但與餌料相比，其富集效應(yīng)未能得到與以往經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中攝食雜色蛤和雙齒圍沙蠶的青蟹對(duì)δ13C的富集效應(yīng)明顯大于2‰，而攝食其余餌料的青蟹對(duì)δ13C的富集效應(yīng)很小或?yàn)樨?fù)數(shù)，表明棲息于潮間帶和淺海的擬穴青蟹與其他河口動(dòng)物相似，對(duì)穩(wěn)定同位素的富集表現(xiàn)有較大的變動(dòng)范圍。2種相手蟹攝食紅樹葉后，δ15N含量隨喂養(yǎng)時(shí)間延長表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的上升趨勢(shì)，但δ13C則無這種趨勢(shì)[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，Δ15N與青蟹體質(zhì)量增長率表現(xiàn)出明顯的對(duì)數(shù)函數(shù)關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)Δ13C與體質(zhì)量增長率之間存在明顯相關(guān)性。日本和美蝦 (Nihonotrypaea japonica)、四角蛤蜊 (Mactra veneriformis)、菲律賓蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 的δ15N和δ13C含量隨著體質(zhì)量增長率的升高，以冪函數(shù)方式朝餌料的穩(wěn)定同位素含量接近，但達(dá)到一定水平后升降趨于平緩[22]。穩(wěn)定同位素的富集效應(yīng)在不同研究中表現(xiàn)出較大差異，這可能與河口和灘涂生物適應(yīng)多變的環(huán)境有關(guān)。

本文為評(píng)估紅樹林及鄰近灘涂棲息的小型動(dòng)物對(duì)擬穴青蟹的營養(yǎng)貢獻(xiàn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)青蟹對(duì)不同餌料的穩(wěn)定同位素具有富集效應(yīng)，但要獲得可用于紅樹林及近海灘涂食物網(wǎng)和食物鏈研究的穩(wěn)定同位素富集參數(shù)，還需要根據(jù)擬穴青蟹的生態(tài)習(xí)性和近海灘涂環(huán)境條件進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，開展更多的實(shí)驗(yàn)研究。