基于可溶性膠原的牙周緩釋劑體外抑菌對照實驗研究

馬苑萍 張振庭 楊圣輝 程 倩 王 昊

牙周炎是最常見的口腔疾病之一，是成年人失牙的主要原因，是主要由牙菌斑引起的牙周支持組織的炎性破壞性、感染性疾病[1]。目前牙周炎治療的主要方法是牙周基礎治療即齦上潔治術、齦下刮治術和根面平整(scaling and root planing，SRP)[2,3]。但是受牙齒解剖形態(tài)、牙周袋深度等原因的影響，治療效果常受到限制，而且有些患者齦上菌斑控制不好，口腔衛(wèi)生差，治療效果也會受到影響，因此局部使用藥物成為了牙周炎基礎治療重要的輔助手段之一[4,5]。與全身給藥相比，牙周局部抗菌緩釋劑具有用藥劑量小，到達病變部位的藥物濃度可保持在有效范圍內(nèi)，有效血藥濃度維持時間長，血藥濃度峰谷波動小等優(yōu)點?？谇痪植拷o藥亦可避免首過效應，提高病人服藥的順應性，在牙周炎的臨床治療中展示了良好的治療效果和應用前景。近年來，尋找具有良好的生物降解性和高度生物相容性，價格低廉，緩釋效果較好的緩釋材料成為牙周緩釋劑的研究熱點，目前牙周緩釋材料主要有脂質(zhì)體、水凝膠、殼聚糖、聚乳酸等[6,7]。本實驗使用的緩釋材料為可溶性膠原(Atelocollagen)。

可溶性膠原(Atelocollagen)是將膠原分子中免疫原性最強的成分-端肽用酶等物質(zhì)處理后再合成，它具有特定的生物學性能，如免疫活性及抗原性低、生物相容性好、能被身體組織吸收、能促進細胞分化及組織再生修復等。膠原所具有的羧基和氨基經(jīng)化學修飾后，可成為新的生物材料。牛皮來源的可溶性膠原很早就已經(jīng)在國外作為整形美容材料用于人體了。去除了端肽后的牛皮膠原，雖然能引起人體的免疫反應，但是對人體是沒有任何危害的[8]。因可溶性膠原良好的生物學性能，它已被廣泛應用于醫(yī)療領域，如人工腎臟透析膜、人工心肺、人工角膜、人工血管、外科手術縫合線等[9]，尤其引人注目的是，可溶性膠原的細胞分化活性可以誘導成骨細胞的粘附及分化[10]，這對牙周組織的修復也有重要的意義。近年來，國外以膠原為緩釋材料的牙周緩釋制劑已被商品化(periodental plus AB)[11,12]，還有研究將膠原作為緩釋材料與甲硝唑聯(lián)合制備成牙周緩釋劑，發(fā)現(xiàn)其有很好的臨床效果[13]。目前，膠原緩釋材料在國內(nèi)還沒有得到很好的應用，本文以牛皮膠原作為緩釋材料，聯(lián)合藥物二甲胺四環(huán)素和環(huán)丙沙星，看其對牙周致病菌的抑菌作用，為下一階段可溶性膠原緩釋劑體內(nèi)實驗提供基礎，為緩釋劑的研制提供理論依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 可溶性膠原緩釋劑的制備

1.1.1 可溶性膠原緩釋材料的制備 將牛皮膠原進行可溶性處理。取生牛皮網(wǎng)狀層做原料，將其絞碎，用10%氯化鈉抽取去除溶解性球蛋白，用乙醚抽取去除脂肪，再用pH8 磷酸緩沖液和pH3.5磷酸三羧酸反復抽取后，經(jīng)酶蛋白水解，低溫分離出可溶性膠原。將可溶性膠原配制成三種不同濃度(1%，2%和3.5%)的膠原原液。(緩釋材料的制備由日本株式會社高研研究所完成)(圖1)。

圖1 可溶性膠原(atelocollagen)

1.1.2 可溶性膠原緩釋劑制備與分組 將二甲胺四環(huán)素(Sunstar INC，日本)與可溶性膠原緩釋材料混合，制備出可溶性膠原二甲胺四環(huán)素緩釋劑，稱為二甲胺四環(huán)素組。將環(huán)丙沙星(中國藥品生物制品檢定所)與可溶性膠原緩釋材料混合，制備出膠原濃度為2%的可溶性膠原環(huán)丙沙星緩釋劑，稱為環(huán)丙沙星組。將環(huán)丙沙星組與二甲胺四環(huán)素組(膠原濃度也為2%)相比，比較兩組牙周緩釋劑對4 種牙周致病菌的抑菌能力差異。

二甲胺四環(huán)素組根據(jù)膠原濃度不同分為一、二、三組，膠原濃度分別為3.5%，2%和1%。對照組為鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派麗奧)組(二甲胺四環(huán)素濃度20mg/ g，Sunstar INC，日本)，未添加膠原成分。二甲胺四環(huán)素組與派麗奧組相比，比較它們的抑菌能力差異。

1.2 配置藥敏培養(yǎng)基 實驗使用的4 種常見牙周炎致病菌，牙齦卟啉單胞菌(P.g)(ATCC 33277)、中間型普氏菌(P.i)(ATCC 25261)、具核梭桿菌(F.n)(ATCC 10953)、粘性放線菌(A.v)(ATCC 19246)(首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院研究所提供)。采用定量懸液法，將這4 種菌株活化、提純和增菌，制作菌懸液，分別取0.1ml 均勻涂入CDC 厭氧血瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 實驗步驟

1.3.1 五組牙周緩釋劑最低抑菌濃度(MIC)檢測 對四組可溶性膠原牙周緩釋劑(二甲胺四環(huán)素三組和環(huán)丙沙星組)以及派麗奧軟膏分別進行活性測定，測量這五組牙周緩釋劑對4 種牙周炎致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。將二甲胺四環(huán)素組和環(huán)丙沙星組用膠原原液依次做3 倍稀釋，派麗奧軟膏用生理鹽水依次做3 倍稀釋，使得五組藥物濃度均由高到低分為10 個梯度(1-10)，分別是21.1mg/ mL，7.033mg/ mL，2.344mg/ mL，0.781mg/ mL，0.260mg/ mL，0.086mg/ mL，0.028mg/ mL，0.009mg/ mL，0.003mg/ mL，0.001mg/ mL。將藥物與CDC 培養(yǎng)基混合后，鋪平皿。每組藥物從濃到稀鋪10 個平皿，并設有兩個空白對照，將稀釋的菌液點種至藥物平皿上，厭氧37℃，培養(yǎng)5d，觀察MIC[14]。

1.3.2 牙周致病菌對五組牙周緩釋劑的藥敏實驗 采用鋼管法進行藥敏實驗，在藥敏培養(yǎng)基上放上消毒過的鋼管，向管內(nèi)加注不同藥物濃度的可溶性膠原緩釋劑和派麗奧，厭氧37℃，培養(yǎng)5d，測量鋼管周圍緩釋劑抵制細菌的生長直徑并記錄。每組重復5 次。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSSl3.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，使用K-S 檢驗證實數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，Levene 檢驗證實數(shù)據(jù)方差齊，應用單因素方差分析對多組實驗結果之間進行檢驗，運用T檢驗對兩組實驗結果之間進行檢驗。檢驗水準α=0.05。P﹤0.05 被認為有統(tǒng)計學差異。

2.結果

所有實驗細菌均生長良好。表1 是五組藥物對4 種常見菌的最低抑菌濃度，均小于0.009mg/ mL。環(huán)丙沙星組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.009mg/ mL，二甲胺四環(huán)素組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.003mg/ mL。表2 是二甲胺四環(huán)素組中的第二組與環(huán)丙沙星組(膠原濃度均為2%)在藥物濃度為0.009mg/ mL、0.003mg/ mL 及0.001mg/ mL 時對4 種常見菌的抑菌環(huán)直徑比較。藥物濃度在0.009mg/ mL 時，二甲胺四環(huán)素組對4 種細菌均表現(xiàn)出比環(huán)丙沙星組更強的抑菌能力(P﹤0.05)；藥物濃度在0.003mg/ mL 時，二甲胺四環(huán)素組對P.g 和F.n 菌株的抑菌能力比環(huán)丙沙星組更強，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)；藥物濃度在0.001mg/ mL 時，二甲胺四環(huán)素組對F.n 和A.v 菌株的抑菌效果比環(huán)丙沙星更好(P﹤0.05)。

表1 五組藥物對4 種牙周致病菌的最低抑菌濃度(mg/ mL)

圖2 為四組藥物對P.g 菌株、P.i 菌株、F.n菌株、A.v 菌株的抑菌實驗結果。對于P.g 菌株，當濃度較高時(﹥2.344mg/ mL)，派麗奧組和二甲胺四環(huán)素組的抑菌效果無明顯差異，隨著藥物濃度的降低，二甲胺四環(huán)素組中的三組牙周緩釋劑的抑菌能力普遍高于派麗奧組，尤其在藥物濃度為0.781mg/ mL(F=96.60，P﹤0.05)和0.009mg/ mL(F=45.11，P﹤0.05)時，表現(xiàn)出比派麗奧明顯更強的抑菌作用(圖2a、圖3)，差異有統(tǒng)計學意義；對于P.i 菌株，藥物濃度為21.1mg/ mL(F=36.59，P﹤0.05)，7.033 mg/ mL(F=72.40，P﹤0.05)以及2.344mg/ mL(F=85.15，P﹤0.05)時，派麗奧組比膠原濃度為2%和1%的二甲胺四環(huán)素組具有更強的抑菌作用，藥物濃度降低至0.086mg/ mL(F=39.87，P﹤0.05)，0.028mg/ mL(F=48.54，P﹤0.05)和0.009mg/ mL(F=20.38，P﹤0.05)時，派麗奧組的抑菌能力則明顯低于二甲胺四環(huán)素組(圖2b、圖4)，差異有統(tǒng)計學意義；對于F.n 菌株，當藥物濃度為0.009mg/ mL(F=67.24，P﹤0.05)，0.003mg/ mL(F=21.80，P﹤0.05)，0.001mg/ mL(F=32.12，P﹤0.05)時，二甲胺四環(huán)素組具有較強的抑菌作用(圖2c、圖5)；對于A.v 菌株，當藥物濃度為0.009mg/ mL(F=15.48，P﹤0.05)和0.001mg/ mL(F=22.77，P﹤0.05)時，二甲胺四環(huán)素組比派麗奧組抑菌能力更強(圖2d、圖6)，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 四組藥物對4 種常見菌的抑菌環(huán)直徑測量結果趨勢圖

圖3 四組藥物對P.g 菌株抑菌環(huán)直徑測量結果。

圖4 四組藥物對P.i 菌株抑菌環(huán)直徑測量結果。

圖5 四組藥物對F.n 菌株抑菌環(huán)直徑測量結果。

圖6 四組藥物對A.v 菌株抑菌環(huán)直徑測量結果

3.討論

牙周緩釋劑是牙周基礎治療有效的輔助手段。牙周緩釋劑中的緩釋材料十分重要，緩釋材料可避免藥物突釋，確保藥物在一定濃度內(nèi)緩慢穩(wěn)定釋放，還可增強藥物的生物相容性和組織靶向性。膠原蛋白因其良好的生物相容性，低免疫原性，優(yōu)良的止血性能成為了緩釋材料的研究熱點[15,16]，本實驗使用的是牛皮膠原中提取的可溶性膠原。實驗結果顯示，環(huán)丙沙星組對中間型普氏菌和具核梭桿菌的MIC 高于二甲胺四環(huán)素組。環(huán)丙沙星組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.009mg/ mL，而二甲胺四環(huán)素組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.003mg/ mL，且在藥物濃度較低時(﹤0.009 mg/ mL)，膠原濃度相同(2%)的環(huán)丙沙星組和二甲胺四環(huán)素組相比，二甲胺四環(huán)素組對4 種牙周致病菌的抑菌能力普遍要高于環(huán)丙沙星組，提示二甲胺四環(huán)素與可溶性膠原結合后的抑菌能力更強。有研究顯示環(huán)丙沙星和二甲胺四環(huán)素都是比較好的牙周炎治療藥物[14]，但是本實驗顯示二甲胺四環(huán)素組的抑菌效能更高，與可溶性膠原結合后，表現(xiàn)出比環(huán)丙沙星組更強的抑菌作用，是牙周緩釋劑比較好的藥物選擇。

在對P.g 菌株的抑菌實驗中(圖2a、圖3)，發(fā)現(xiàn)當濃度較高時(﹥2.344mg/ mL)，派麗奧組和二甲胺四環(huán)素組的抑菌效果無明顯差異，但是當藥物濃度為小于0.781mg/ mL，濃度逐漸降低時，二甲胺四環(huán)素組卻比派麗奧組有更強的抑菌作用，表明可溶性膠原緩釋劑可以比較穩(wěn)定地維持藥物的療效，避免藥物的突釋，促進藥物地緩慢釋放，這也提示可溶性膠原作為緩釋材料的可行性。

在對P.i 菌株的抑菌實驗中(圖2b、圖4)，可以看出當藥物濃度處于較高的水平時(﹥2.344mg/ mL)，可溶性膠原濃度為3.5%的二甲胺四環(huán)素組比膠原濃度為1%和2%的二甲胺四環(huán)組的抑菌作用更強，提示膠原的濃度可能影響藥物的抑菌作用，但是兩者之間量效關系如何，還需要進一步的實驗來驗證。此外，在對P.i 菌株的抑菌實驗中，高藥物濃度時，派麗奧組出現(xiàn)了比膠原濃度為1%和2%的二甲胺四環(huán)組更強的抑菌作用，但是隨著藥物濃度的降低，派麗奧組的抑菌能力則逐漸低于二甲胺四環(huán)素組，這也進一步表明可溶性膠原緩釋劑藥效的穩(wěn)定性。在對F.n 和A.v 菌株的抑菌實驗中(圖2c、圖2d，圖5、圖6)在藥物濃度較高時，二甲胺四環(huán)素組和派麗奧組均表現(xiàn)出了良好的抑菌作用，但是在藥物濃度較低時(﹤0.009mg/ mL)，派麗奧組的抑菌作用則低于二甲胺四環(huán)素組。可溶性膠原牙周緩釋劑在藥物濃度較低時還能保持比較好的抑菌效能，在一定程度上說明了可溶性膠原較好的緩釋作用，促使藥物能比較穩(wěn)定緩慢地釋放，這在臨床上是有很有意義的，但是受實驗樣本量的限制，未來我們還需要進一步的實驗來驗證這一觀點。

可溶性膠原牙周緩釋劑良好穩(wěn)定的抑菌性能是其能運用于臨床的基礎條件之一?，F(xiàn)在臨床上廣泛應用的派麗奧軟膏的主要成分也是二甲胺四環(huán)素，添加物的主要成分是羥乙基纖維素，派麗奧抗菌作用強，局部濃度高，藥物緩慢釋放，在牙周袋內(nèi)停留時間長，是非常好的牙周緩釋劑，但是它是一種溶性油脂緩釋劑，遇水變?yōu)檩^硬的高粘度凝膠狀，不易從牙周袋流出，不能被組織吸收，這是需要改善的地方，而可溶性膠原可以在體內(nèi)完全降解，可代謝吸收，這也是當前臨床使用的派麗奧所不能達到的[17]。此外，可溶性膠原與宿主細胞之間有良好的相互作用，可促進不同類型細胞生長，它的成骨作用可以促進牙周組織的修復，這也是它對于其它緩釋材料的優(yōu)勢[18]。本實驗發(fā)現(xiàn)可溶性膠原牙周緩釋劑對4 種口腔牙周常見致病菌均有良好的抑菌作用。在藥物濃度降低時，其作用優(yōu)于牙周緩釋劑派麗奧，提示可溶性膠原作為牙周緩釋材料的應用價值，但是從實驗階段過渡到臨床應用，還需要做大量的工作和更深入的研究。