外泌體源性miRNAs在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展

龔 婷，王正根

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是世界上三種最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬新發(fā)病例和50萬死亡病例[1]。早期CRC患者的5年生存率接近90%，如果早期確診有被治愈的可能，且早期診斷和早期治療可以顯著提高CRC患者的總生存率[2]。結(jié)腸鏡檢查有較高的診斷率，但因檢查不便且具有侵入性，可能引起相關(guān)并發(fā)癥而將其限制在二級(jí)預(yù)防中。目前的篩查方法，如糞便隱血實(shí)驗(yàn)（fecal occultblood test,FOBT）、糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)都有各種局限性，只有30%-40%的患者在早期被發(fā)現(xiàn)[3]。癌胚抗原（carcino embryonic antigen,CEA）是一種傳統(tǒng)的血清生物標(biāo)志物，用于監(jiān)測(cè)CRC復(fù)發(fā)，但由于其低靈敏度和特異性，并不是合適的診斷性生物標(biāo)志物。外科手術(shù)、放化療及靶向治療在結(jié)直腸癌的治療方面均有一定進(jìn)展，但治療效果欠佳。因此，發(fā)現(xiàn)具有高靈敏度和特異性的血清生物標(biāo)志物以促進(jìn)CRC的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估是有必要的。外泌體miRNAs是腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中信號(hào)交流的重要媒介，幾乎參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)生物學(xué)過程。本文就外泌體miRNAs在CRC中的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后評(píng)估等方面進(jìn)行綜述。

1 外泌體簡(jiǎn)介

1.1 外泌體的生物學(xué)特征 外泌體是由正常或癌變細(xì)胞的細(xì)胞膜衍生的囊泡，大小在30 nm-100 nm[4]、40 nm-100 nm[5]、50 nm-150 nm[6]不等，釋放入如功能性細(xì)胞外液（血液、淋巴液及組織液等）、膽汁、母乳、尿液和唾液等各種體液中[7]。外泌體中富含多種生物活性物質(zhì)，包括核酸（如miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA）、蛋白（如融合蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、熱休克蛋白）、脂質(zhì)（如膽固醇、磷脂）等，其成分不同取決于源細(xì)胞的功能狀態(tài)[8]。有多種機(jī)制參與外泌體的釋放過程，其中最主要的機(jī)制是多囊體與細(xì)胞膜融合。釋放的外泌體可通過直接融合、受體-配體融合或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等方式被受體細(xì)胞吸收[9]。大部分進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)的外泌體將被溶酶體所降解以供細(xì)胞代謝所需，僅有小部分的外泌體釋放出內(nèi)容物，并以此介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊主要有以下三種方式：①外泌體膜蛋白與靶細(xì)胞膜蛋白相結(jié)合，激活靶細(xì)胞信號(hào)通路；②在細(xì)胞外基質(zhì)中，蛋白酶切割外泌體膜蛋白，然后與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合以激活細(xì)胞膜細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路；③外泌體膜可直接與靶細(xì)胞膜融合，刺激外泌體源性蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA的非選擇性釋放[10,11]。有研究[12-14]表明，轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成依賴于腫瘤來源的外泌體。外泌體的功能取決于它們來源的細(xì)胞類型[15,16]，不同細(xì)胞類型來源的外泌體具有不同的功能。腫瘤來源的外泌體參與腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的遺傳信息交流，導(dǎo)致大量新生血管形成，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲[17,18]。

1.2 外泌體miRNAs微小RNAs（miRNAs）是一類長(zhǎng)度為18-22個(gè)核苷酸單鏈的非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)及控制各種細(xì)胞機(jī)制，包括各種腫瘤發(fā)生和發(fā)展[19-21]。miRNA代表了研究最多的非編碼RNA類，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)高達(dá)60%的蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)[22]。miR?NA其中一個(gè)最重要特征在于其多靶點(diǎn)潛力，例如單個(gè)miRNA靶點(diǎn)多達(dá)200個(gè)mRNAs，而不同的miRNA可以調(diào)節(jié)相同的mRNA靶點(diǎn)[23]。外泌體miRNAs作為腫瘤基質(zhì)-腫瘤細(xì)胞間信號(hào)交流的重要媒介，幾乎參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)生物學(xué)過程[24,25]。血清外泌體miRNAs豐度較高、穩(wěn)定性好，且更容易標(biāo)準(zhǔn)化，有望成為CRC早篩早診、病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)估的新型生物標(biāo)志物[26,27]。相關(guān)研究[28]表明，外泌體miRNAs在血液循環(huán)中能穩(wěn)定存在的有以下原因：①外泌體納米級(jí)別的直徑大小可以避免被吞噬；②外泌體本身攜帶CD47、CD55和CD59等分子，可避免被循環(huán)單核?巨噬細(xì)胞清除而穩(wěn)定存在；③miRNA具有囊泡膜保護(hù)，可免受體液中的酶類物質(zhì)降解[29]。

2 外泌體miRNAs與CRC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移

近年來很多研究表明外泌體miRNAs在CRC發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Bigagli E等[30]研究顯示，外泌體miR-210高表達(dá)能減弱細(xì)胞間的相互作用及增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲性，這可能是促進(jìn)結(jié)腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）的機(jī)制之一。miR-92a是致癌miR簇miR-17-92的成員，位于染色體13q13，該區(qū)域促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制癌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤血管生成，并加速CRC的進(jìn)展[31]。Zhang G等[32]研究顯示外泌體miR-92a在CRC中顯著上調(diào)，導(dǎo)致E-cadherin下調(diào)及β-catenin和vimentin上調(diào)，從而通過PTEN（phosphate and tension homology de?leted on chromsome ten,PTEN）/胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3’-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（ser?ine/threonine-specific protein kinase,Akt）途徑與其靶標(biāo)PTEN的相互作用參與調(diào)控EMT，PTEN是目前發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。miR-200c是miR-200家族的成員，主要參與調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子中的E盒結(jié)合鋅指蛋白（zinc finger E-box-binding pro?tein，ZEB），誘導(dǎo)miR-200c抑制ZEB1的表達(dá)，從而減少CRC細(xì)胞的侵襲和遷移[33]。PROX1可通過與前miR-9-2啟動(dòng)子結(jié)合抑制上皮鈣黏蛋白編碼基因表達(dá)，從而促進(jìn)EMT[34]。叉頭框（forkhead box，F(xiàn)OX）轉(zhuǎn)錄家族的兩個(gè)成員FOXQ1和FOXM1是miR-320c的靶點(diǎn)，其參與EMT誘導(dǎo)過程。

外泌體miR-21作為致癌miRNAs，通過PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)大腸癌中PTEN的表達(dá)[35]。Bhome R等[36]使用小鼠模型研究顯示外泌體miR-21從腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast,CAF）轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞增加了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力，這歸因于這種miRNA對(duì)不同的腫瘤抑制基因（如PTEN和PDCD4）具有抑制作用。Asangani I A等[37]報(bào)道稱miR-21通過PDCD4 3’-UTR中的nt228-249-CDR的特定結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)調(diào)控腫瘤抑制因子PDCD4，并促進(jìn)CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移。失活的let-7a與高水平的KRAS、c-MYC及CRC的發(fā)生有關(guān)[38]，而let-7 KRAS rs712多態(tài)性與CRC風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[39]，鼠類肉瘤病毒癌基因途徑的激活可以觸發(fā)并上調(diào)某些致癌miRNAs（如miR-210、miR-181a、miR-200c），其在CRC發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[40]。Sun D等[41]研究表明miR-31可通過直接識(shí)別RAS p21 GTP酶的3’-UTR的特定位置激活RASA1轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)并刺激腫瘤發(fā)生。外泌體的間接作用也被描述為免疫系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，如骨髓源性抑制細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和單核細(xì)胞。這些細(xì)胞有利于腫瘤逃脫免疫監(jiān)視[42,43]。Takano Y等[44]研究表明CRC來源外泌體能夠在體內(nèi)啟動(dòng)肝臟轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，并提出由CRC細(xì)胞釋放的外泌體miR-203，由單核細(xì)胞內(nèi)化，從而促進(jìn)M2標(biāo)記的表達(dá)。這表明外泌體miRNAs的可能參與單核細(xì)胞分化為M2-腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞[45]。Wang X等[46]研究表明，CRC細(xì)胞釋放的外泌體可能激活SDF1介導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞向肝臟生態(tài)位的趨化作用。這表明外泌體miRNAs通過招募表達(dá)CXCR4的細(xì)胞，包括免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓來源細(xì)胞和干細(xì)胞，形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，促進(jìn)CRC的肝轉(zhuǎn)移。因此，在CRC的血清中檢測(cè)到外泌體miR-203的高表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后因素，與轉(zhuǎn)移潛能增加和生存期縮短相關(guān)[44]。外泌體miRNAs在CRC發(fā)生及演進(jìn)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，幾乎參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)生物學(xué)過程。外泌體miRNA與CRC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 外泌體miRNAs在CRC臨床中的應(yīng)用

3.1 外泌體miRNAs作為CRC診斷與預(yù)后標(biāo)志物 腫瘤來源的RNA被包裝在外泌體磷脂雙層內(nèi)可避免血清核糖核酸酶的降解，是腫瘤患者診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物，目前這項(xiàng)技術(shù)被稱為“液體活檢”[47]。Chen X等[48]研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者與健康人血清中的miRNA的表達(dá)水平是不同的，已經(jīng)確定至少有69種miRNAs分子只能在CRC患者的血清中被檢測(cè)到。miR-21、let-7g、miR-31、miR-92a、miR-181b及miR-203這六種血清外泌體miRNA，已被證明是可靠的診斷CRC的生物標(biāo)志物，與癌胚抗原（carcino embryonic antigen,CEA）和CA19-9等經(jīng)典標(biāo)志物相比，特異性和敏感性超過40%[49]。Ogata-Kawata H等[50]研究分析了CRC患者的血清外泌體miRNA，并將其與健康對(duì)照組進(jìn)行了比較，鑒定出了16種差異表達(dá)的miRNA，包括：let-7a、miR-21、miR-23a、miR-150、miR-181b、miR-181d、miR-223、miR-483-5p、miR-638、miR-1224、miR-1229、miR-1246、miR-1268、miR-1290、miR-1308和miR-1915。進(jìn)一步分析顯示miR-1246和miR-23a的敏感性最高，分別為95%及92%，是有希望診斷CRC的生物標(biāo)志物。Vychytilova-Falte js?kova P等[51]在144例CRC患者和96例健康人群血清中發(fā)現(xiàn)54個(gè)miRNAs顯著下調(diào)，其中4個(gè)miRNA（miR-23a-3p、miR-27a-3p、miR-142p和miR-376c-3p）被確定為診斷性生物標(biāo)志物，對(duì)早期CRC具有較高的鑒別能力（81%的敏感性和特異性，AUC=0.877）。Wang J等[52]研究證表明血清外泌體miR-125a-3p和miR-320c在部分CRC晚期患者中顯著上調(diào)，血清外泌體miR-125a-3p和CEA的聯(lián)合檢測(cè)著著提高了早期診斷CRC的能力。有些外泌體miRNAs通過靶向ZEB1和ZEB2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[53]。Wang D S等[54]發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-103水平升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤分期有關(guān)，反映了它參與了CRC的進(jìn)展。其他血清外泌體miRNAs，如miR-506、miR-4316、miR-182和miR-30a-5p也已被認(rèn)為是早期CRC檢測(cè)的潛在標(biāo)志物[55-57]。Zhu M等[58]對(duì)來自196名CRC患者和138名健康人的血清樣本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p、miR-21-5p和miR425-5p的表達(dá)水平在CRC中顯著升高。因此，在中風(fēng)險(xiǎn)CRC人群中檢測(cè)這些血清外泌體miRNAs的表達(dá)水平可以作為一種篩查CRC的無創(chuàng)檢測(cè)方法。

據(jù)相關(guān)研究[59,60]報(bào)道，血清外泌體miR-200c、miR-203與EMT相關(guān)，具有很強(qiáng)的生物標(biāo)志物價(jià)值，可作為CRC預(yù)后和預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。Tsukamoto M等[61]研究顯示血清外泌體miR-21是II-III期CRC患者DFS和OS以及IV期CRC患者總生存期（overall sur?vival,OS）的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。血清外泌體miR-6803-5p高水平與CRC患者較短的無病生存期（dis?ease freesurvival,DFS）和OS顯著且獨(dú)立相關(guān)，在晚期患者及肝轉(zhuǎn)移患者中預(yù)測(cè)價(jià)值更高[62]。其他血清外泌體miRNAs（例如miR-17-92a、miR-92、miR-638、miR-19a、miR-548c-5p、miR-27a、miR-130a）被認(rèn)為與CRC患者預(yù)后不良相關(guān)[63,64]。這些外泌體miRNAs血清水平升高與淋巴/血管浸潤(rùn)或短期無進(jìn)展生存期有關(guān)，有助于確定新的預(yù)后生物標(biāo)志物，以早期識(shí)別腫瘤切除后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者[65-67]。這些都體現(xiàn)了血清外泌體miRNAs可作為CRC預(yù)后標(biāo)志物，對(duì)CRC患者預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。

3.2 外泌體在CRC治療中的應(yīng)用 外泌體miR-21的高表達(dá)與5-氟尿嘧啶的化療耐藥有關(guān)。Valeri N等[68]證明miR-21的過表達(dá)直接靶向抑癌基因突變體人類DNA MutS同系物2（hMSH2）的3'-UTR，并顯著下調(diào)其表達(dá)，從而顯著降低5-FU誘導(dǎo)的G2/M損傷阻滯和凋亡。Deng J等[69]進(jìn)一步研究顯示miR-21過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖和侵襲，抑制化療藥物5-FU對(duì)CRC HT29細(xì)胞的凋亡作用。外泌體miR-196b-5p的過表達(dá)也被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞通過靶向調(diào)節(jié)SOCS1和SOCS3（STAT3信號(hào)通路的兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子）對(duì)5-FU耐藥的另一個(gè)標(biāo)志[70]。Jin G等[71]研究發(fā)現(xiàn)了一組血 清 外 體miRNAs（miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p及miR-96-5p），可以區(qū)分對(duì)常規(guī)化療敏感的CRC患者，敏感性為78%，特異性為88.90%。以上研究對(duì)外泌體miRNAs與CRC化療耐藥關(guān)系進(jìn)行了闡述，為CRC的臨床治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。外泌體具有運(yùn)送貨物的生物學(xué)功能，Samanta S等[72]研究表明外泌體可以作為靶向藥物的載體，精準(zhǔn)地破壞腫瘤細(xì)胞。Dai S等[73]對(duì)腹水來源外泌體（ascites exosome，Aex）與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）聯(lián)合應(yīng)用于CRC患者的免疫治療進(jìn)行了I期臨床試驗(yàn)。這種治療發(fā)方法可能是一種有益的、腫瘤特異性的抗腫瘤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic tlymphocyte,CTL）反應(yīng)，可能給晚期CRC患者免疫治療的提供新思路。Kamerkar S等[74]研究來自正常成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)細(xì)胞的外泌體可攜帶特定siRNA或短片的細(xì)胞發(fā)夾RNA（sh-RNAs）到KRASG12D胰腺癌細(xì)胞，其在多種小鼠模型中被證明具有良好的抗腫瘤活性。Zhao H等[75]研究顯示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞衍生的外泌體包含完整的代謝產(chǎn)物，包括氨基酸、脂質(zhì)和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle,TCAcycle）中間體。癌細(xì)胞利用CDEs的中心碳代謝促進(jìn)腫瘤在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下生長(zhǎng)，因此，抑制腫瘤外泌體的釋放或阻斷腫瘤的外泌體miRNAs的功能也可能成為治療CRC的新策略。

4 小結(jié)與展望

外泌體miRNAs是腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中信號(hào)交流的重要媒介，幾乎參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的全部生物過程。許多研究表明CRC中異常表達(dá)的miRNA通常與CRC發(fā)生發(fā)展或轉(zhuǎn)移相關(guān)。血清外泌體miRNA是一種很有潛力的診斷和治療CRC的生物標(biāo)志物，然而，外泌體miRNA在CRC中的作用機(jī)制、早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估等方面的研究仍具有巨大的挑戰(zhàn)。對(duì)其深入研究及將相關(guān)問題不斷完善，為發(fā)展優(yōu)越的CRC篩查方法、治療靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物開辟新前景，為更好的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。