苦參堿對變形鏈球菌生物被膜的抑制作用研究

楊若琪 王靜 張穎穎

摘要?[目的]評估苦參堿對變形鏈球菌致齲性（如生長、產(chǎn)酸、生物被膜形成和細菌代謝活性）的影響。[方法]通過結(jié)晶紫染色測定苦參堿對生物被膜形成的抑制作用與已成熟生物被膜的根除作用，通過pH計測定苦參堿對變形鏈球菌產(chǎn)酸的影響，通過MTT法測定了苦參堿對變形鏈球菌浮游細胞與生物被膜細胞代謝活性的影響。[結(jié)果]苦參堿能夠顯著抑制變形鏈球菌的生長與生物被膜的形成，對已成熟的生物被膜也有根除作用。苦參堿處理后變形鏈球菌有機酸的產(chǎn)生明顯減少，同時變形鏈球菌浮游細胞和生物被膜細胞的代謝活性也受到了抑制。[結(jié)論]苦參堿可以抑制致齲性生物被膜，是預(yù)防齲齒的候選藥物之一。

關(guān)鍵詞?苦參堿;變形鏈球菌;生物被膜;抑制作用

中圖分類號?R285?文獻標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）09-0168-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.045

Abstract?[Objective]To evaluate the effect of matrine on the cariogenicity of Streptococcus mutans （such as growth，acid production，biofilm formation and bacterial metabolic activity）.[Method]The inhibitory effect of matrine on the formation of biofilms and the eradication of mature biofilms were measured by crystal violet staining.The effect of matrine on the acid production of S.mutans was measured by a pH meter.The effect of matrine on the metabolic activities of S.mutans planktonic cells and biofilm cells was determined by MTT method.[Result]Matrine could significantly inhibit the growth of S.mutans and the formation of biofilms，and it could also eradicate mature biofilms.After treatment with matrine，the production of organic acids by S.mutans was significantly reduced，and the metabolic activities of its planktonic cells and biofilm cells were also inhibited.[Conclusion]Matrine can inhibit cariogenic biofilms and is one of the candidate drugs for preventing dental caries.

Key words?Matrine;Streptococcus mutans;Biofilm;Inhibitory effect

盡管如今的牙科技術(shù)發(fā)展迅速，但是許多人依然無法擺脫牙齒疾病的痛苦。有數(shù)據(jù)顯示，牙齒疾病每年給全球造成的經(jīng)濟損失高達2 980億美元，占全球醫(yī)療總支出的4.6%[1]。齲齒是目前最常見的牙齒疾病之一。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）是一種革蘭氏陽性細菌，被認為是主要的致齲病原體[2]。變形鏈球菌能夠代謝食物中的糖類并產(chǎn)生有機酸，從而腐蝕牙釉質(zhì)的表面，導(dǎo)致齲齒的形成[3]。同時，變形鏈球菌在牙齒表面形成的生物被膜（也稱為牙菌斑）也是引起齲齒的重要原因之一[4]。

生物被膜是包裹在自身產(chǎn)生的胞外聚合物基質(zhì)中的微生物聚集體。牙齒生物被膜的形成是一個復(fù)雜的過程，變形鏈球菌首先黏附在牙齒的表面，隨后進行定殖并與其他口腔細菌聚集形成牙菌斑[5]。在這個過程中，變形鏈球菌通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTFase）合成水不溶性葡聚糖，為細菌在牙齒表面的黏附提供了結(jié)合位點，并促進了生物被膜的形成[6]。生物被膜中的細菌通常表現(xiàn)出與浮游細菌完全不同的特性，例如對抗菌藥物耐藥性的增強[7]。因此，抑制牙齒生物被膜的形成是齲齒預(yù)防的主要策略之一。

氟化物在齲齒的預(yù)防上起著重要的作用，但高濃度的氟化物具有細胞毒性[8]。洗必泰也是一種常用的抗齲藥物，然而頻繁使用洗必泰會加速牙結(jié)石的形成[9]。近年來，人們對天然產(chǎn)物用作新型抗齲藥物的興趣日益增加。與傳統(tǒng)的抗齲藥物相比，天然產(chǎn)物具有良好的效果，并且細胞毒性較低，更適合臨床應(yīng)用。

苦參堿是豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait）、苦豆子（S.alopecuroides L.）、廣豆根（S.subprostrata Chun et T.Chen）等中草藥的活性成分，是苦參堿類生物堿的代表，這一類生物堿是一種具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)的生物堿，還包括氧化苦參堿、槐果堿、槐醇堿、槐胺堿、氧化槐果堿等[10]，苦參堿的生物活性十分廣泛，具有抗菌[11]、抗病毒[12]、抗炎[13]、免疫調(diào)節(jié)[14]、抗腫瘤[15]等作用。有研究表明，苦參堿在抗菌方面具有良好的活性，能夠抑制大腸埃希菌[16]、表皮葡萄球菌[17]和結(jié)核桿菌[18]等細菌的生長，但對苦參堿作用于口腔主要致齲細菌——變形鏈球菌的相關(guān)研究較少。該試驗探究了苦參堿對變形鏈球菌生長、產(chǎn)酸、生物被膜以及代謝活性的影響。

1?材料與方法

1.1?試驗材料?苦參堿（上海源葉生物科技有限公司）;變形鏈球菌（S.mutans）UA159，由山東中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室提供;BHI培養(yǎng)基（批號20190508，北京奧博星生物技術(shù)有限公司）。

1.2?主要儀器設(shè)備

一次性無菌培養(yǎng)皿（直徑90 mm，新星實驗器材公司）;蘇凈安泰BSC-1300IIA生物潔凈安全柜（蘇凈集團）;麥?zhǔn)媳葷峁埽ㄗ灾疲?96孔板（新星實驗器材公司）;普朗DNM-9602酶標(biāo)儀 （北京普朗公司）;pH計（上海虹益儀器儀表有限公司，型號PHS-3C）;PBS （福州飛凈生物科技有限公司）;MTT （江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，5?mg/mL）。

1.3?試驗方法

1.3.1?抗菌活性測定。

通過微量稀釋法測定苦參堿的抗菌活性。將90 μL含有1%葡萄糖的BHI培養(yǎng)基添加到96孔板的每個孔中。然后將配制好的苦參堿溶液進行2倍連續(xù)稀釋，使之濃度為10.00、5.00、2.50、1.25?mg/mL，并設(shè)置空白對照。向每個孔中添加10 μL在BHI培養(yǎng)基中過夜生長的變形鏈球菌UA159菌液（0.05OD，600 nm）。將96孔板在37 ℃下無氧培育24 h。最后在630 nm處測定OD值，結(jié)果取3次測定數(shù)值的平均值。

1.3.2?產(chǎn)酸試驗。

為了測定苦參堿對變形鏈球菌產(chǎn)酸的影響，按照“1.3.1”所述分組進行藥液的稀釋與細菌的接種。培育24 h后，使用pH計測量每個孔的pH。在接種變形鏈球菌之前，還測量含有各種濃度苦參堿的BHI培養(yǎng)基的初始pH。每個濃度平行測定3次，結(jié)果取平均值。

1.3.3?結(jié)晶紫染色。

通過結(jié)晶紫染色法測定苦參堿對生物被膜形成的抑制作用。將變形鏈球菌UA159的過夜培養(yǎng)物加入含有不同濃度苦參堿（1.25、2.50、5.00、10.00 mg/mL）的BHI肉湯中（同時設(shè)立空白對照）。在37 ℃下無氧培育24 h后，用無菌PBS輕輕洗去多余的培養(yǎng)基和浮游細菌。隨后使用無水甲醇固定生物被膜15 min，并晾干。加入0.2%的結(jié)晶紫（CV）溶液染色。10 min后，棄去多余的染料，用無菌PBS沖洗2次，向每個孔中加入33%的乙酸溶液，以溶解用于染色生物被膜的結(jié)晶紫。最后在630 nm下測定OD值，結(jié)果取3次測定數(shù)值的平均值。

為了測定苦參堿對已成熟生物被膜的根除作用，需要在96孔板中建立24 h生物被膜模型。具體方法：將過夜培養(yǎng)的變形鏈球菌UA159菌液添加到含有1%葡萄糖的BHI培養(yǎng)基中，在37 ℃下無氧培育24 h后，小心除去浮游細菌，并用無菌PBS洗滌形成的生物被膜。將各種濃度的苦參堿添加到每個孔中，在37 ℃下無氧培育24 h，隨后按照上述步驟進行染色，測定結(jié)果。

1.3.4?MTT試驗。

通過MTT法測定苦參堿對變形鏈球菌浮游細胞代謝活性的影響。將變形鏈球菌UA159在含有10.00、5.00、2.50、1.25 mg/mL苦參堿的BHI肉湯中于37 ℃下無氧培育4 h（含空白對照）。然后向每個孔中添加10 μL 5?mg/mL的MTT，將96孔板在37 ℃下無氧培育4 h。最后每孔加入100 μL 100%的DMSO溶液，振蕩培育10 min。使用酶標(biāo)儀測量490 nm處的OD值，每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值（代謝活性=試驗組OD值/對照組OD值×100%）。

為了測定苦參堿對變形鏈球菌生物被膜細胞代謝活性的影響，如“1.3.3”所述建立24 h生物被膜模型，與各種濃度的苦參堿共同無氧培育24 h后，小心除去含有苦參堿的BHI培養(yǎng)基，并用無菌PBS再次洗滌形成的生物被膜，隨后按照上述步驟進行MTT檢測。

2?結(jié)果與分析

2.1?苦參堿對變形鏈球菌浮游細胞生長的抑制作用

從圖1可以看出，當(dāng)苦參堿濃度增大時，變形鏈球菌的生長受到明顯的抑制;苦參堿對變形鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）為10.00 mg/mL;各個濃度和對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明苦參堿對變形鏈球菌具有較強的抗菌作用，能夠顯著抑制變形鏈球菌浮游細胞的生長。

2.2?苦參堿對變形鏈球菌產(chǎn)酸的影響?用各種濃度（1.25～10.00 mg/mL）的苦參堿處理細菌，并測量pH的變化，以確定苦參堿是否抑制變形鏈球菌的產(chǎn)酸。結(jié)果如表1所示，在細菌培養(yǎng)前，對照組培養(yǎng)液的起始pH為6.89，無氧培育24 h后，培養(yǎng)液的pH顯著降低至5.19;當(dāng)用1.25和2.50 mg/mL的苦參堿處理后，pH的下降有所減少;用5.00和10.00 mg/mL的苦參堿處理后，pH的下降受到明顯的抑制。結(jié)果表明苦參堿可以抑制變形鏈球菌產(chǎn)生有機酸。

2.3?苦參堿對變形鏈球菌生物被膜形成的抑制作用

從圖2可以看出，當(dāng)苦參堿濃度增大時，對應(yīng)的OD值隨之降低，說明變形鏈球菌生物被膜的生物量逐漸減少，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明苦參堿對變形鏈球菌生物被膜的形成具有良好的抑制作用，且作用效果是呈濃度依賴性。

2.4?苦參堿對變形鏈球菌已成熟生物被膜的根除作用

與浮游細胞相比，生物被膜中的細胞更難被殺死。試驗建立了24 h生物被膜模型，通過結(jié)晶紫染色測定各種濃度的苦參堿對已成熟生物被膜的根除作用。結(jié)果如圖3所示，隨著苦參堿濃度的增加，OD值逐漸降低，表明生物被膜的數(shù)量持續(xù)減少;與對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。由此可以看出，苦參堿可以有效破壞已形成的生物被膜。

2.5?苦參堿對變形鏈球菌浮游細胞和生物被膜細胞代謝活性的影響

通過MTT法測定各種濃度的苦參堿對變形鏈球菌浮游狀態(tài)下和生物被膜狀態(tài)下代謝活性的影響。用10.00、5.00、2.50、1.25 mg/mL的苦參堿在BHI培養(yǎng)基中處理變形鏈球菌的浮游細胞或生物被膜細胞，使用DMSO溶解形成的甲臜結(jié)晶。MTT試驗結(jié)果（圖4）表明，與未處理的對照組相比，苦參堿以濃度依賴性的方式降低了變形鏈球菌浮游細胞和生物被膜細胞的代謝活性，與對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3?結(jié)論與討論

變形鏈球菌是引起齲齒的主要致病菌，因此控制變形鏈球菌在口腔中的生長非常重要。該試驗綜合研究了苦參堿對變形鏈球菌的抑制作用，結(jié)果表明，苦參堿可抑制變形鏈球菌的生長，拮抗其產(chǎn)生有機酸，分散變形鏈球菌生物，并能降低其細胞代謝活性。

在牙菌斑形成的過程中，pH是主要的影響因素之一。變形鏈球菌通過糖酵解途徑產(chǎn)生的有機酸會降低牙菌斑的pH，使牙釉質(zhì)脫礦并引起齲齒[19]。因此，pH的變化可以作為確定抗齲藥物效果的指標(biāo)。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，苦參堿抑制了變形鏈球菌引起的pH降低，說明在苦參堿的作用下，變形鏈球菌產(chǎn)生的有機酸減少。該結(jié)果與Kim等[20]用甘菊揮發(fā)油對變形鏈球菌產(chǎn)酸的抑制效果類似。

生物被膜是一類結(jié)構(gòu)和組成非常復(fù)雜的細菌群落，與浮游細胞相比，生物被膜中的細菌細胞需要更高濃度的藥物才能殺死，這是因為胞外聚合物基質(zhì)為生物被膜中的細菌細胞提供了保護作用[21]。變形鏈球菌在牙齒表面形成的生物被膜創(chuàng)造了一個厭氧和酸性的環(huán)境，從而加速了齲齒的形成[22]。因此，阻礙牙齒生物被膜的形成是控制齲齒的有效方法。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些來源于植物的化合物對變形鏈球菌具有抗生物被膜活性，例如來源于姜黃根莖的姜黃素[23]和梗樹果實的柚皮素[24]。在該研究中，通過結(jié)晶紫染色法評估了苦參堿是否會影響變形鏈球菌生物被膜的形成，結(jié)果顯示，苦參堿以濃度依賴性的方式抑制了變形鏈球菌生物被膜的形成。成熟的生物被膜具有更強的存活能力，一旦生物被膜形成并黏附在物體表面上，根除生物被膜將變得非常困難[25]。該研究通過建立24 h生物被膜模型來測定苦參堿對已成熟生物被膜的影響，結(jié)果顯示，苦參堿能夠分散預(yù)先形成的變形鏈球菌生物被膜。

細胞代謝活性可能在生物被膜形成的過程中起著關(guān)鍵作用。MTT法是基于將四氮唑鹽還原為甲臜的原理，以確定微生物和哺乳動物細胞的活力。Khan等[26]研究發(fā)現(xiàn)牛至中的香芹酚通過降低變形鏈球菌的代謝活性以抑制生物被膜的形成。同樣該研究的結(jié)果表明，苦參堿可以顯著影響變形鏈球菌浮游細胞和生物被膜細胞的代謝活性，從而進一步驗證了苦參堿對變形鏈球菌的抗菌作用和抗生物被膜能力。

該試驗結(jié)果表明，苦參堿對變形鏈球菌的生長、代謝及其生物膜的形成都有一定的抑制作用。由此可見，苦參堿有作為新型抗齲藥物開發(fā)的潛力，如將其開發(fā)為含漱液等類型非口服制劑，可望有較好的抗齲齒效果，亦可避免其毒性對人體產(chǎn)生影響。當(dāng)然，在苦參堿應(yīng)用于口腔齲齒治療之前，應(yīng)對其毒性進行充分檢測，確定其安全劑量。同時，以分子生物學(xué)等手段開展進一步具體研究，以確定苦參堿治療和預(yù)防齲齒的分子機制。

參考文獻

[1] LISTL S，GALLOWAY J，MOSSEY P A，et al.Global economic impact of dental diseases[J].Journal of dental research，2015，94（10）：1355-1361.

[2] LOESCHE W J.Role of Streptococcus mutans in human dental decay[J].Microbiological reviews，1986，50（4）：353-380.

[3] QUIVEY R G JR，KUHNERT W L，HAHN K.Genetics of acid adaptation in oral streptococci[J].Critical reviews in oral biology and medicine，2001，12（4）：301-314.

[4] NYVAD B，CRIELAARD W，MIRA A，et al.Dental caries from a molecular microbiological perspective[J].Caries research，2013，47（2）：89-102.

[5] WIATER A，CHOMA C，SZCZODRAK J.Insoluble glucans synthesized by cariogenic streptococci：A structural study[J].Journal of basic microbiology，1999，39（4）：265-273.

[6] ZHAO W，LI W Q，LIN J C，et al.Effect of sucrose concentration on sucrose-dependent adhesion and glucosyltransferase expression of S.mutans in children with severe early-childhood caries （S-ECC）[J].Nutrients，2014，6（9）：3572-3586.

[7] MERRITT J，KRETH J，QI F X，et al.Non-disruptive，real-time analyses of the metabolic status and viability of Streptococcus mutans cells in response to antimicrobial treatments[J].Journal of microbiological methods，2005，61（2）：161-170.

[8] FEATHERSTONE J D B.Remineralization，the natural caries repair process：The need for new approaches[J].Advances in dental research，2009，21（1）：4-7.

[9] ARAU′JO N C，F(xiàn)ONTANA C R，GERBI M E M，et al.Overall-mouth disinfection by photodynamic therapy using curcu min[J].Photomedicine and laser surgery，2012，30（2）：96-101.

[10] 張明發(fā)，沈雅琴.苦參堿類生物堿免疫促進作用的研究進展[J].藥物評價研究，2019，42（3）：579-585.

[11] 張玉玲，岳曉琪，張艷麗.苦豆子生物堿體外抑菌活性的檢測[J].輕工科技，2019，35（7）：33-34.

[12] 程培培，李劍勇，楊亞軍，等.苦參堿的抗病毒作用研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（2）：7-9.

[13] 智信，陳曉，蘇佳燦.苦參堿藥理作用研究進展[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，40（1）：123-127.

[14] 李軍，司維柯，趙宸，等.苦參堿與氧化苦參堿影響荷瘤小鼠腫瘤生長及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（27）：2719-2721.

[15] 張明發(fā)，沈雅琴.苦參堿和氧化苦參堿抗大腸癌藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2020，43（6）：1189-1196.

[16] 秦菊.苦參堿對大腸埃希菌體外生物膜形成抑制的作用研究[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2015.

[17] 官妍，馬越，程惠娟，等.苦參堿對表皮葡萄球菌生物被膜作用初探[J].微生物學(xué)通報，2011，38（1）：91-96.

[18] 李洪敏，馮端浩，曹晶，等.中藥苦參堿對結(jié)核桿菌的抑制作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2002，18（6）：383-385.

[19] KHLER B，BIRKHED D，OLSSON S.Acid production by human strains of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus[J].Caries research，1995，29（5）：402-406.

[20] KIM B S，PARK S J，KIM M K，et al.Inhibitory effects of Chrysanthemum boreale essential oil on biofilm formation and virulence factor expression of Streptococcus mutans[J].Evidence-based complementary and alternative medicine，2015，2015：1-11.

[21] JHAJHARIA K，PAROLIA A，SHETTY K V，et al.Biofilm in endodontics： A review[J].Journal of international society of preventive & community dentistry，2015，5（1）：1-12.

[22] MARQUIS R E.Oxygen metabolism，oxidative stress and acid-base physiology of dental plaque biofilms[J].Journal of industrial microbiology，1995，15（3）：198-207.

[23] LI B C，LI X L，LIN H C，et al.Curcumin as a promising antibacterial agent： Effects on metabolism and biofilm formation in S.mutans[J].BioMed research international，2018，2018：1-11.

[24] YUE J X，YANG H Y，LIU S Y，et al.Influence of naringenin on the biofilm formation of Streptococcus mutans[J].Journal of dentistry，2018，76：24-31.

[25] RMLING U，BALSALOBRE C.Biofilm infections，their resilience to therapy and innovative treatment strategies[J].Journal of internal medicine，2012，272（6）：541-561.

[26] KHAN S T，KHAN M，AHMAD J，et al.Thymol and carvacrol induce autolysis，stress，growth inhibition and reduce the biofilm formation by Streptococcus mutans[J].AMB Express，2017，7（1）：1-11.